菌落總數(shù)、大腸菌群測定方法

1、菌落總數(shù)和大腸菌群測定（固體樣品）藥 品：1、平板計數(shù)瓊脂2、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）3、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）4、氯化鈉設(shè)備材料：燒杯 、三角瓶、廣口瓶、培養(yǎng)皿、刻度吸管、倒氣管、玻璃棒、試管、硅膠塞、洗耳球、棉花、布或報紙等。一、 準(zhǔn)備工作（指導(dǎo)書是按一個樣品所需物品準(zhǔn)備的，實(shí)驗(yàn)室可按樣品量增加）1、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基準(zhǔn)備-用于菌落總數(shù)測定 將三角瓶放在電子稱上，去皮，按平板計數(shù)瓊脂使用說明稱量，加200ml蒸餾水?dāng)嚢瑁烹姞t上煮沸加熱煮沸，充分溶解，蓋上硅膠塞，用報紙或布包好，再用橡皮筋扎緊。2、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯-用于大腸菌群測定（a）將燒杯放在電子稱上

2、，去皮，按使用說明稱量，加100ml蒸餾水?dāng)嚢?，放電爐上煮沸，充分溶解。（b）用10ml（毫升）的吸管分裝到9支(18*180規(guī)格)試管中，每支試管加10ml的月桂基溶液LST（合計90毫升）。（c）9支試管分別放入倒氣管（開口向下），排氣，蓋上硅膠塞。3、0.85%的生理鹽水-用于樣品稀釋將廣口瓶去皮，稱取氯化鈉1.91g加225ml蒸餾水，搖勻，用報紙或布包好，再用橡皮筋扎緊； 同樣配制第二瓶。4、準(zhǔn)備2個空試管，蓋上硅膠塞-用于樣品稀釋。5、準(zhǔn)備8個培養(yǎng)皿，用布包扎好。6、準(zhǔn)備至少3支5ml和1支10ml帶有刻度的吸管，用布包扎好（頂部可用棉球塞住，防止吸液時，液體不慎吸入洗耳球）。7、

3、準(zhǔn)備操作的工具：剪刀1把、鑷子1個、勺子等打開產(chǎn)品包裝所需工具，用布包扎好。二、使用滅菌鍋滅菌 1、檢查滅菌鍋底部加熱管水位是否正常，水位要高過加熱絲。 2、將上面準(zhǔn)備好的7步驟物品逐一放入鍋內(nèi)，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、蓋上滅菌鍋蓋子時，將排氣管插到排氣口內(nèi)，注意從對角線開始擰緊螺絲，將排氣閥打開（安全閥始終關(guān)閉），通電后，待排氣閥放氣3分鐘后（鍋內(nèi)冷空氣已經(jīng)排完），關(guān)閉排氣閥。 4、查看滅菌鍋的壓力表，當(dāng)溫度升到121，壓力升到0.1MP(兆帕)時，滅菌維持15分鐘后(溫度和壓力不能過高或者過低)，斷電自然冷卻到接近“0”度后，慢慢打開排氣閥，再對角擰開滅菌鍋。三、無菌操作

4、 進(jìn)無菌室前的準(zhǔn)備：放好工具（酒精燈，記號筆，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，電子稱），打開紫外線殺菌燈，殺菌30分鐘后關(guān)閉，再等10分鐘后進(jìn)入無菌室。（無菌室緩沖間應(yīng)放有：白色衣服、帽子、鞋子和口罩等）。 1、待滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s后，取出6件滅菌好的物品，留下平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)在滅菌鍋里待用（該液體涼后會凝固，應(yīng)保持溫度50左右）。2、用75%的酒精棉球消毒手和操作臺面。3、點(diǎn)著酒精燈，準(zhǔn)備接種，接種過程在酒精燈周圍10cm范圍進(jìn)行。4、無菌操作 A、拿出第一瓶生理鹽水，用10毫升的吸管分別吸9ml生理鹽水加入2個空的試管中，再吸1ml的生理鹽水，放入1個培養(yǎng)皿內(nèi)（這是生理鹽水空白試驗(yàn)用

5、的）。（10ml吸管使用3次，不再使用） B、準(zhǔn)備制樣，用75%的酒精棉球擦拭樣品包裝準(zhǔn)備開口處，拿出第二瓶生理鹽水，放在電子稱上，去皮，稱取或量取25g（mL）樣品，放入225ml生理鹽水中充分搖勻，制成稀釋10倍的檢測樣品，即10-1溶液。（注意搖勻）（見書中最后1頁圖） C、取出第一個5ml的吸管，吸取5ml的“檢測樣品10-1溶液”，分別放入2個培養(yǎng)皿和3個試管中，各放1ml，再吸取1ml“檢測樣品10-1溶液”放入9ml生理鹽水的試管中，制成稀釋100倍的檢測樣品，即10-2溶液。（注意搖勻） D、取出第二個5ml的吸管，吸取5ml的“檢測樣品10-2溶液”，分別放入2個培養(yǎng)皿和3個

6、試管中，各放1ml，再吸取1ml放入9ml生理鹽水的試管中，形成稀釋1000倍的檢測樣品，即10-3溶液。（注意搖勻） E、取出第三個5ml的吸管，吸取5ml的“檢測樣品10-3溶液”，分別放入2個培養(yǎng)皿和3個試管中，各放1ml。（注意搖勻）（詳見書中最后1頁圖）。F、取出滅菌鍋內(nèi)的三角瓶（平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)），用手感覺瓶子熱度（以45-50度為宜，過熱或過低均不行），分別倒入8個培養(yǎng)皿內(nèi)15-20ml平板計數(shù)培養(yǎng)基，注意倒入時僅拿開一點(diǎn)點(diǎn)蓋子，并在酒精燈邊上操作，左右搖勻，待平板計數(shù)培養(yǎng)基凝固后，倒置培養(yǎng)皿。其中有1個培養(yǎng)皿是用于做平板計數(shù)培養(yǎng)基空白試驗(yàn)的。四、培養(yǎng) 要求培養(yǎng)箱溫度

7、在（361）度，培養(yǎng)時間在（482）小時，將8個培養(yǎng)皿（倒置）和9個試管均放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。五、檢查結(jié)果、計算（1）計算大腸菌群：培養(yǎng)24h取出9個試管，觀察是否有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，渾濁即為產(chǎn)酸、倒氣管懸空即為產(chǎn)氣，有幾個試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即準(zhǔn)備做幾個煌綠乳糖膽鹽肉湯試管，煌綠和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，做法同樣！即：看藥品使用說進(jìn)行配制，稱量-煮沸溶解-分裝-加入倒氣管-排氣-塞硅膠塞-滅菌備用。1類結(jié)果：均無產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢驗(yàn)值是：30MPN/100g。2類結(jié)果：煌綠試管有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，查看各稀釋度產(chǎn)酸產(chǎn)氣個數(shù)，對照書中“倒數(shù)第2頁”表格，找出結(jié)果后乘以100，再保留2位有效數(shù)字（例如：4.3102）（2）計算菌落總數(shù)：取出8個培養(yǎng)皿，逐一觀察，不論菌落大小，連在一起的計算為1個，如果菌落比較多，可以分成4個區(qū)來計數(shù)。1類結(jié)果：空白試驗(yàn)的2個培養(yǎng)皿，發(fā)現(xiàn)菌落，則環(huán)境污染了，本次試驗(yàn)失敗。2類結(jié)果：對照書“第3頁-第4頁”，有6種可能出現(xiàn)的情況，對照對應(yīng)情況進(jìn)行計算。注意