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1、第四章 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化,生命科學(xué)學(xué)院: 柯德森 D QQ270820679,研究意義: 了解蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系是理解蛋白質(zhì)分子自我裝配過(guò)程的關(guān)鍵. 研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性機(jī)制是實(shí)現(xiàn)酶工程研究目標(biāo)的重要基礎(chǔ).,第一節(jié): 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,一. 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性: 蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響,保持其生物活力的能力. 蛋白質(zhì)的特定功能是由其特定的空間結(jié)構(gòu)決定的,要保持其生物活力,必須保持其空間結(jié)構(gòu),穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的因素是什么?,理解蛋白質(zhì) 穩(wěn)定性的概念?,維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素:,金屬離子、底物、輔因子和其他相對(duì)低分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的

2、作用 鹽橋和氫鍵 二硫鍵 對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量較低 氨基酸殘基的堅(jiān)實(shí)裝配 疏水相互作用(思考題),疏水性標(biāo)尺,疏水性氨基酸越多越穩(wěn)定?,疏水性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)系小結(jié),疏水性大小與穩(wěn)定性沒(méi)有必然的聯(lián)系 非極性氨基酸在蛋白質(zhì)球體內(nèi)的規(guī)則的排列是穩(wěn)定性的原因之一 增加疏水作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的實(shí)用方法:降低蛋白質(zhì)表面的疏水性,增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性,二. 測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法,比較蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的準(zhǔn)則包括: 熔化溫度Tm;蛋白質(zhì)伸展一半時(shí)的變性劑濃度 蛋白質(zhì)自由能; 最大穩(wěn)定性溫度(Ts); 在特定溫度下蛋白質(zhì)功能活性維持時(shí)間.,思考,熔化溫度Tm和蛋白質(zhì)伸展50%時(shí)的變性劑濃度是預(yù)測(cè)酶穩(wěn)定性的

3、最有用參數(shù); Tm: 蛋白質(zhì)受熱伸展過(guò)渡中點(diǎn)時(shí)的溫度; 變性劑濃度: 蛋白質(zhì)加變性劑伸展過(guò)程中使蛋白質(zhì)伸展一半時(shí)所需要的變性劑濃度;,蛋白質(zhì)失活的原因和機(jī)理,蛋白質(zhì)水解酶和自溶作用 聚合作用: 蛋白質(zhì)首先發(fā)生可逆性伸展,伸展的蛋白質(zhì)分子彼此締合,以最大限度減少疏水氨基酸暴露于水溶劑,最后可能發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成,從而使蛋白質(zhì)沉淀析出.蛋白質(zhì)的聚合作用可能是不可逆的,并不一定是不可逆的.,思考,聚合如果發(fā)生共價(jià)鍵就是不可逆的?,極端pH: 活性中心氨基酸必需基團(tuán)電離. pH的變化可以引起蛋白質(zhì)的伸展,這個(gè)過(guò)程原則上是可逆的,但這些變化常能導(dǎo)致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 氧化

4、作用: 各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。分子氧、H2O2和氧自由基是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氧化劑。 表面活性劑和去污劑 表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性.其中陰離子去污劑的作用比陽(yáng)離子和非離子去污劑強(qiáng)烈.,變性劑: 脲和鹽酸胍:機(jī)制尚不明確,可能是消除了維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水作用力或直接與蛋白質(zhì)分子作用. 高濃度鹽:高濃度鹽既有穩(wěn)定作用也有變性作用,這要看鹽的性質(zhì)和濃度。 螯合:常常不可逆地失活需要金屬輔因子的酶,但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子的酶; 有機(jī)溶劑:改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù);增加疏水核的溶解度,降低帶電表面的溶解度;奪去酶分子表面

5、的必需水而使酶失活.,重金屬離子和巰基試劑: 與蛋白質(zhì)的巰基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)。 熱:熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常遇到的酶失活的原因.熱失活也分二步過(guò)程:伸展-不可逆失活. 機(jī)械力: 振動(dòng)、剪切、超聲波、壓力都可能引起蛋白質(zhì)的變性,這種變性理論上是可逆的,但也可能伴隨著其他反應(yīng)而不可逆地失活。 冷凍和脫水: 冷凍和脫水時(shí),溶質(zhì)被濃縮,引起酶微環(huán)境中pH和離子強(qiáng)度的劇烈改變,減弱疏水相互作用,并可能引起二硫交換和巰基的氧化。 輻射作用: 輻射可產(chǎn)生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或間接地作用于蛋白質(zhì)分子.,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化,一是如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展,可以開(kāi)發(fā)出普遍適用

6、的方法; 二是一旦酶發(fā)生了可逆伸展,如何防止其不可逆失活反應(yīng)的發(fā)生,對(duì)此針對(duì)不同的失活原因采取不同的特殊穩(wěn)定化方法。,一. 固定化:,固定化穩(wěn)定酶的因素:空間障礙、機(jī)械方式的空間限制。 空間障礙:由于空間障礙可以防止蛋白水解酶的作用,阻擋酶與化學(xué)失活劑的接觸,同時(shí)阻礙氧向酶的擴(kuò)散可以保護(hù)對(duì)氧不穩(wěn)定的酶。 機(jī)械方式: 使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密的孔中可以使酶的構(gòu)象更加堅(jiān)牢,從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過(guò)渡。,空間限制引起的 表觀穩(wěn)定性,非共價(jià)修飾,反相膠束 添加劑:專(zhuān)一性底物及配體;非專(zhuān)一性中性鹽和多羥基物質(zhì);與失活劑競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì);除掉破壞化學(xué)催化劑的物質(zhì) 蛋白質(zhì)間非共價(jià)相連,化學(xué)修飾:,修飾

7、作用可達(dá)到穩(wěn)定酶的作用,得到可溶性穩(wěn)定化酶。 可溶性大分子修飾酶: 聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、肝素等。,小分子修飾酶 原因: 修飾有時(shí)會(huì)獲得不同于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的更穩(wěn)定的構(gòu)象; 修飾關(guān)鍵功能基團(tuán)也會(huì)達(dá)到穩(wěn)定化; 由化學(xué)修飾引入到蛋白質(zhì)的新的功能基有可能形成附加氫鍵或鹽鍵; 用非極性試劑修飾可加強(qiáng)蛋白質(zhì)中疏水相互作用; 蛋白質(zhì)表面基團(tuán)的親水性; 交聯(lián)酶晶體,蛋白質(zhì)工程:,用基因操縱技術(shù)高度專(zhuān)一性地改變目標(biāo)蛋白質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn):提供了有目的改變酶性能的可能性,不僅改變酶的結(jié)構(gòu),也可以改變其催化活力及專(zhuān)一性和穩(wěn)定性。 定點(diǎn)突變是其技術(shù)上的主要思路: 工程二硫鍵; 增加蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性; 酶表面的親水化 抗氧化失活; Asn脫胺失活;,手段:同源雜色體交換?,思考題,什么叫蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?如何理解蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性這個(gè)概念? 影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要因素有哪些?如何理解疏水性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)系? 蛋

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