體內(nèi)藥物分析_薄層色譜法　PPT課件.ppt

1、1,色譜法,色譜法是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法，其分離原理主要是利用物質(zhì)在流動相和固定相中的分配系數(shù)、或吸附能力等的差異而得到分離。,隨著臨床藥學(xué)的迅速發(fā)展，色譜法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用更為廣泛，具有不可取代的重要地位，已成為體內(nèi)藥物分離檢測最重要的方法,2,液相色譜法是應(yīng)用最廣的分離分析方法， 特別是對于復(fù)雜樣品的分析尤為重要。液相色譜法的分支很多， 廣義的液相色譜法包括：高效液相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、毛細(xì)管電泳法等類別， 而它們又各自包括多種方法。,色譜法包括紙色譜、薄層色譜、凝膠色譜、氣相色譜和液相色譜,3,第一節(jié) 薄層色譜法（TLC）,是指將固定相均勻地涂布在具有

2、光潔表面的玻璃、塑料或金屬膜等表面上形成薄層，將被分離物質(zhì)點(diǎn)在薄層板的一端，置展開室中，展開劑借毛細(xì)管作用從薄層點(diǎn)樣的一端展開到另一端，在此過程中不同物質(zhì)可以進(jìn)行色譜分離。,根據(jù)不同的分離機(jī)制，薄層色譜法可以分為吸附薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和凝膠薄層色譜。,4,薄層色譜的特點(diǎn)： 可以同時平行分離多個樣品；分析成本低；對樣品預(yù)處理要求低；薄層板一次性使用，對樣品要求不高；對固定相、展開劑的選擇自由度大。,傳統(tǒng)的TLC法缺點(diǎn)： 展開時間長、展開劑體積需求大和分離結(jié)果差等。其色譜結(jié)果易受鋪板質(zhì)量、點(diǎn)樣技術(shù)、展開劑配制、層析環(huán)境中展開劑的飽和度、環(huán)境溫、濕度等因素的影響，有時難于重復(fù)；

3、顯色易受均勻性、靈敏度、穩(wěn)定性等影響，這均使測定結(jié)果偏差較大。,5,是近年來迅速發(fā)展的一種高效、快速、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的薄層色譜新技術(shù)，它采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素等為固定相，對吸附劑進(jìn)行疏水和親水改性，可以實現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性，已廣泛用于各個領(lǐng)域。,高效薄層色譜法 high performance thin-layer chromatography (HPTLC),與傳統(tǒng)TLC相比，高效薄層色譜法在薄層制備、展開方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設(shè)備等方面進(jìn)行了 許多改革，其中最根本的是固定相的改進(jìn)。,6,7,而在TLC、HPTLC和U

4、PTLC三種規(guī)格的預(yù)制硅膠薄層板中，又以HPTLC最能體現(xiàn)出薄層色譜分析效率高且經(jīng)濟(jì)實用的特點(diǎn)。其應(yīng)用在目前的科研和日常分析中越來越得到普及。無定形HPTLC硅膠的平均粒徑和粒徑分布范圍相對TLC有較大改善，以較短的展開距離和時間就可以獲得較高的理論塔板數(shù)和分離度。 由于成分斑點(diǎn)更為集中，因此所需的有效涂層厚度也大為減少，檢測靈敏度也因而較TLC有一個數(shù)量級的提高。,8,C18：弱極性,Diol: 二醇醚改性,CN：丙基腈改性,NH2：丙氨基改性,9,10,11,12,兩個基本要求： 第一，點(diǎn)樣位置需精確； 第二，尤其對于定量分析，點(diǎn)樣體積需要精確和準(zhǔn)確。,點(diǎn)樣,為了提高分離效率，原點(diǎn)在展開方

5、向應(yīng)該盡可能小，對于HPTLC，應(yīng)小于1.5mm，,點(diǎn)狀點(diǎn)樣：體積受到嚴(yán)格限制。在HPTLC板上點(diǎn)狀點(diǎn)樣體積通常為0.1-1L。溶劑在板上擴(kuò)散會“環(huán)形色譜”。 非接觸噴霧式條帶狀點(diǎn)樣：均勻，可提高解析度和檢測限。,由于HPTLC擴(kuò)散小，10*10cm板可點(diǎn)16個樣品,13,14,薄層色譜有別于其他色譜技術(shù)，除了都有固定相和流動相外，還存在氣相。氣相會對分離結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。展開室預(yù)先用展開劑飽和 展開距離 由于TLC中流動相的速度不是固定的，而是隨展開時間和展開距離增加而降低，所以展開距離有一定限制。通常在HPTLC板上5cm展距分辨率較高,展開,15,1、顯色劑顯色法：噴霧顯色，借助噴霧器噴

6、細(xì)霧至板面濕潤。 2、紫外線照射法：如AFTB1在WL365nm觀察； 3、對本身是有色的斑點(diǎn)則不需顯色。,顯色,16,1、定性：斑點(diǎn)顯色后量出高度，求得Rf值 2、定量方法 目視直接比較法 洗脫測定法 薄層掃描法,定性定量,17,薄層掃描法一般由薄層掃描儀完成。該儀器一般由下列部分組成計算機(jī)、光源、單色光器、監(jiān)測器、打印機(jī)、記錄儀。按測定方法分可分為透射法、反射法。按其掃描方式可分為線性掃描法、鋸齒掃描法、飛點(diǎn)掃描法或稱之為微光點(diǎn)快速掃描法。瑞士和日本島津類型儀器所采用的是鋸齒掃描或飛點(diǎn)掃描法。目前是以鋸齒掃描和飛點(diǎn)掃描法為佳。,18,19,20,21,瑞士卡瑪CAMAG公司的儀器,全自動、

7、 半自動、 手動點(diǎn)樣儀 條帶狀噴霧式樣品點(diǎn)樣,22,CAMAG全自動展開儀（ADC2）,薄層板切割器:,23,西洋參在UV366下的色譜圖（指紋圖譜）,Visualizer數(shù)碼成像系統(tǒng),24,薄層色譜掃描儀、工作站 可進(jìn)行薄層色譜光密度分析,一整套儀器要30多萬人民幣,25,例子： 高效薄層色譜法測定人血清中鹽酸胺碘酮,鹽酸胺碘酮為臨床上常用的抗心律失常藥物，其治療指數(shù)低安全范圍窄，且個體差異大，為了解治療效果與血藥濃度的關(guān)系，我們建立高效薄層色譜法(HPTLC)。本法操作簡便易行，不失為臨床鹽酸胺碘酮監(jiān)測的有效方法。,26,供試品溶液的制備,精密量取血清1. 0 mL置磨口試管中，加入 l.

8、0 mL pH3鹽酸溶液，再加人3.0 mL的氯仿，振蕩，移出氯仿層。提取兩次。將兩次氯仿液合并，于55水浴上蒸干，點(diǎn)樣前用約0.1 mL 氯仿溶解。,27,薄層色譜條件,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別點(diǎn)于同一含羧甲基纖維素鈉(為粘合劑)的硅膠60 GF254薄層板上，以無水乙醇一氨水(50：1)為展開劑水平展開，取出晾干，置紫外燈(254nm)下確定斑點(diǎn)位置。斑點(diǎn)顏色為黑褐色,28,采用雙波長反射法鋸齒掃描：測定波長242nm，參比波長370rim；背景補(bǔ)償；線性參數(shù)Sx：3；掃描步距Y=004；狹縫寬度0.4mm0.4mm。薄層掃描圖見圖2。,薄層掃描條件,29,血清標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,分別精密吸取對照品溶液(濃度為1.0gmL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0L加人磨口試管中，再加人血清l.0mL，按供試品溶液的制備方法操作,30,取同一對照品溶液，分別點(diǎn)于5塊含羧甲基纖維素(為粘臺劑)的硅膠60GF 薄層板上(4種不同點(diǎn)樣量)依法展開后掃描測定。吸收數(shù)據(jù)見表3。,板間誤差測定：,穩(wěn)定性試驗、板內(nèi)誤差測定、儀器精密度測定、回收率試驗 都很好,3