FISH.ppt

1、FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點治療中的應(yīng)用,細胞遺傳學(xué)技術(shù) 原理：通過熒光標記的DNA探針與細胞核內(nèi)的DNA 靶序列雜交 觀察：熒光顯微鏡 原位觀察（細胞、組織）細胞核 彩色探針信號 目的：獲得細胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種 基因狀態(tài)的信息。,Fluorescence in situ hybridization （FISH）,用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位,原理,centrome

2、re,telomere subtelomere,locus specific,whole chromosome paint,FISH探針的種類,操作流程簡圖,FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用,乳腺癌 Her-2基因,致癌基因：Her-2基因； 位點：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長因子受體部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴增； HER-2基因擴增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標。,Her-2基因的檢測方法,Her-2基因FISH 探針組,結(jié)果判斷,統(tǒng)計Ratio值（計數(shù)浸潤性部分的20個細胞） Ratio值20個細胞核中紅信號總數(shù)/

3、綠信號總數(shù) Ratio1.8 為陰性結(jié)果 Ratio2.2或眾多信號連接成簇時可不計算為陽性結(jié)果 比值24為低度擴增 410為中度擴增 10為高度擴增 Ratio在1.8-2.2 之間時，則需要再計數(shù)20個細胞核中 的信號。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報告中注明。,A. 無須計數(shù)的大簇團信號（高度擴增）,B. 顆粒狀信號（R10，高度擴增）,C. 須計數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴增）,A,C,B,Her-2基因擴增狀況,Her-2基因無擴增情況,紅信號數(shù)2，同時綠信號非整倍體R1.8，無擴增,紅信號與綠信號均為兩點，R=1,熒光原位雜交與免疫組化檢測Her-2結(jié)果比較,我實驗室已完成

4、病例小結(jié),IHC,0 1+ 2+ 3+,FISH,無擴增 13 3 4 0 20,擴增 2 2 10 29 43,總數(shù),(n=15) (n=5) (n=14) (n=29) （n=63）,Her2表達IHC（2+）標本中，基因擴增率為71.41% Her2表達IHC（3+）標本中，基因擴增率為100%,（文獻報道：90-95%）,30%的腫瘤細胞全部 的細胞膜高強度著色,免疫組化（3+）與FISH對比圖,40,100,住院號：177319 浸潤性導(dǎo)管癌級 IHC：+ FISH：呈簇團狀高度擴增,100,30%的腫瘤細胞弱的著色,免疫組化（1+）與FISH對比圖1,住院號：175689 浸潤性導(dǎo)

5、管癌級 IHC：+ FISH： Ratio1.62，無擴增,免疫組化（1+）與FISH對比圖2,40,100,住院號：175895 浸潤性導(dǎo)管癌級 IHC：+ FISH：簇狀擴增,30%的腫瘤細胞弱的著色,免疫組化（）與FISH對比圖1,100,40,住院號：176846 浸潤性導(dǎo)管癌級 IHC： FISH： Ratio1.02， Her2基因無擴增,30%的腫瘤細胞弱的著色或不著色,免疫組化（）與FISH對比圖2,住院號：175472 浸潤性導(dǎo)管癌級 IHC： FISH：呈簇狀擴增,腫瘤細胞不著色,評價17號染色體的意義,17號染色體非整倍性：每個細胞中17號染色體多于或少于2個； 乳腺癌遺

6、傳學(xué)特征之一，可能預(yù)示預(yù)后不良； 17號染色體多體性是導(dǎo)致IHC 3+但FISH檢測為陰性的主要原因； 我實驗室完成病例中17號染色體非整倍性發(fā)生率為33.3%。,評價Her-2基因狀態(tài)的同時應(yīng)考慮 17號染色體數(shù)目的變化,IHC與FISH結(jié)果不一致原因分析,IHC判斷標準的主觀性 內(nèi)對照探針17號染色體著絲粒探針的建立， 排除IHC假陰性 IHC 2+及3+的基因檢測結(jié)果分離，無法控制 由于17號染色體多體性造成假性擴增 IHC自身無法克服的缺陷,基因擴增是Herceptin 使用的關(guān)鍵性指標,Her2基因檢測流程,石蠟組織標本,IHC檢測,再用FISH 方法檢測,1+,3+,2+,+,He

7、rceptin治療,+,再用FISH 方法檢測,Herceptin治療,FISH檢測,+,再用FISH 方法檢測,+,乳腺癌HER2 FISH檢測報告模板,FISH技術(shù)檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應(yīng)用,淋巴瘤的診斷與分型,難,HEIHC + cytogenesis = 解決!,不同類型的淋巴瘤有各自不同的染色體易位,使控制細胞發(fā)育分化過程中的關(guān)鍵蛋白失活,與淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),IGH/BCL2 t (14;18) (q32;q21) 染色體易位 IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色體易位 IGH/CCND1 t(11; 14)(q13;q32)染色體易位 API2/M

8、ALT1 t(11;18)(q21;q21)染色體易位 IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21)染色體易位 BCR/ABL t(9;22)染色體易位【費城染色體】,目前開展的染色體易位檢測（6種）：,t (14;18) (q32;q21) 染色體易位,意義： t (14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能編碼完整BCL2 蛋白，IGH基因附近的增強子使BCL2 過表達 t (14;18)為FL的標志（低級別更易出現(xiàn)）,檢出率達93%100% DLBCL 20% 30%出現(xiàn)易位 影響檢出率的原因： 石蠟標本中DNA的降解 FL3b接近DLBCL，其易位率低，影響總體檢出率

9、,IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,探針雜交示意圖,腫瘤細胞核IGH/BCL2 雙色雙融合 易位探針雜交后顯示1O1G2F信號,細胞核IGH/BCL2雙色雙融合 易位探針雜交后顯示2O2G信號,病例1：會診84363，男，74y 腹腔腫物； FISH：54%的細胞可見融合信號； 診斷：FL。,100,病例2：會診84362，女、36 頸部腫物 抗炎治療后（出現(xiàn)變性壞死） 診斷：DLBCL FISH：陽性，10%的細胞可見融合信號,t (8;14) (q24;q32) 染色體易位,意義： t (8;14)易位后形成的IGH/

10、MYC基因能編碼完整MYC蛋 白，IGH基因附近的增強子使MYC過表達 應(yīng)用范圍： 所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位 診斷不典型Burkitt淋巴瘤須有t (8;14)易位的MYC異常 可見于繼發(fā)于濾泡性淋巴瘤的前驅(qū)B淋巴母細胞白血病/ 淋巴瘤,MYC,8q24 region,14q32 region,IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe,探針雜交示意圖,正常細胞核IGH/MYC, CEP8 三色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G2A信號,腫瘤細胞核IGH/MYC 雙色雙融合 易位探針雜交后顯示1O1G2

11、F信號,10,40,病例3: 399318，女、5y 頸淋巴結(jié)活檢； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的細胞可見融合信號； 診斷：散發(fā)性經(jīng)典型BL。,病例4: 405618，女，21y 盆腔腫物穿刺； ISH: EBERs（+）； FISH: 23%的細胞可見融合信號； 診斷：考慮為散發(fā)性經(jīng)典型BL。,4,40,活檢穿刺標本,病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 經(jīng)多學(xué)科大會診； 診斷：較符合散發(fā)性非典型BL； FISH: 25%的細胞可見融合信號；,4,40,活檢穿刺標本,t (11; 14)(q13;q32)染色體易位,意義 t (11;14)易位后形

12、成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增 強子使 Cyclin D1過表達 應(yīng)用范圍 套細胞淋巴瘤的診斷性指標 也出現(xiàn)過零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的檢出,IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe,11q13 region,14q32 region,簡潔示意圖,探針雜交示意圖,10,40,IHC:CyclinD1,病例6: 393301，男，40y； 肘部腫物； IHC：CyclinD1弱陽性； 經(jīng)科內(nèi)會診； FISH:21%的細胞可見融合信號； 診斷：MCL,所示箭頭為染色體易位 產(chǎn)生的融合信號（100）,10,CyclinD1,40,病例7: 386766，女，67y 扁桃體活檢2塊，直徑0.3CM IHC：CyclinD1弱陽性； FISH:45%的細胞可見融合信號； 診斷：不排除MCL的可能，重取活檢；,形態(tài)不典型+IHC不理想,FISH檢測標本要求,新鮮活檢或手術(shù)切除標本； 石蠟包埋組織或石蠟切片（35um）； 腫瘤穿刺活檢組織或細胞涂片； 骨髓穿刺組織盡量送涂片，不用活檢組織（因為脫鈣需要使用鹽酸，破壞DNA）； 腫瘤細胞陽性的胸腹水涂片； 一般在3個工作日后可以發(fā)出檢測報告；,EBV-DNA定量PCR結(jié)果的穩(wěn)定性分析,EBV-DNA定量PCR標準樣品擴增曲線,鼻咽癌檢測結(jié)果比較,5個不同樣