生物制藥工藝學(xué) 第12章 制備型HPLC.ppt

1、第十二章 制備型高效液相色譜,制備型高效液相色譜的用途：,1重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝優(yōu)化、中試以及大規(guī)模生產(chǎn)的必備手段。,2天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的重要手段: 蛋白質(zhì),多肽,多糖?？咕?3從天然產(chǎn)物來源藥品生產(chǎn)的重要手段：胰島素，蘄蛇酶。 4實驗室制備樣品用于臨床試驗和報批。 5 在 2-D 電泳, blotting, ELISA 等之前的樣品制備。,第一節(jié) 高效液相色譜法簡介,1.1 液相色譜的發(fā)展史 1903年，色譜法問世。 俄國植物學(xué)家茨維特 1903年3月21日， 大會報告 “一種新型 吸附現(xiàn)象及其在生化 分析上的應(yīng)用” 1906年 在德國植物學(xué)雜志發(fā)表 文章，首次命名上述分 離后色帶

2、為色譜圖，稱此方法為色譜法,1931年，庫恩（Kuhn）分離胡蘿卜素，1938年，Kuhn和Lederer從維生素B中分離出B6，獲得了1938年的諾貝爾化學(xué)獎。 1941年，馬丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色譜法，1952年度的諾貝爾獎。,60年代末，70年代初，高效液相色譜儀的成功研制 高效填料，高壓泵，儀器檢測,1.2 基本儀器裝置,輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 收集系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),2 1 高效液相色譜儀組成,1 輸液系統(tǒng),(1) 高壓輸液泵 作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。 輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。,(2)在線

3、脫氣裝置 作用：脫去流動相中的溶解氣體。流動相先經(jīng)過脫氣 裝置再輸送到色譜柱。 超聲脫氣、真空脫氣等,脫氣不好時有氣泡，導(dǎo)致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。,Pressure Dampers,O2, N2, CO2,（3）梯度洗脫裝置,Isocratic elution,恒定組成的單一溶劑體系,Gradient elution,以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗， 目的是分離多組容量因子相差較大的組分,High-Pressure Mixing,2 進樣系統(tǒng),六通閥,3 分離系統(tǒng),3.1色譜柱,3.2色譜柱填料,spherical and irregular silica particl

4、es,Macroporous spherical silica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979,基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)m數(shù)十m，球形。 硅膠或有機高分子聚合物,Pellicular particle,Porous particle,30-50m,1-2m,3-10m,3.3色譜柱填料,功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合,檢測系統(tǒng)：,收集系統(tǒng)：,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：,三、高效液相色譜法的特點,采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高靈敏度檢測器, 從而實現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。 和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點：快速、靈敏度高、分辨率高、自動化程

5、度高 等。,四、制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜法的區(qū)別,輸液泵不同： 兩種泵設(shè)計的特點及其性能,檢測器中的檢測池不同 ： 體積不同 色譜柱不同： 規(guī)格主要是直徑，粒徑的大小,制備色譜一般配有電導(dǎo)檢測器和pH值檢測器分析型色譜沒有： 制備色譜一般配備收集器分析型色譜沒有,五、色譜的基本理論及有關(guān)參數(shù),兩大理論： 塔板理論(the plate model):闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成；相似于精餾過程，色譜分離也是一個分配平衡過程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2,速率理論:研究各種動力

6、學(xué)因素對峰展寬的影響。 H= A+Cu,有關(guān)參數(shù),容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動相中總摩爾數(shù)之比。容量因子k與柱效參數(shù)及定性參數(shù)密切相關(guān)，而且比分配系數(shù)易于測定，在色譜分析法中一般都是用容量因子代替分配系數(shù)。,選擇因子（selectivity factor,）： 相鄰兩組份的分配系數(shù)或容量因子之比。設(shè)k2k1，則k2/k1，所以又稱為相對保留時間（美國藥典）。要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。,分離度：在色譜過程中表示兩

7、組分相互分離的程度,一般情況下,分離度大于1.5時稱分離完全. 只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。 在色譜分析中要求： 兩組分的保留值差別要足夠大。 兩色譜峰要足夠窄。 待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能短.,六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)：,Capacity:純化過程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量。可以是體積也可以是質(zhì)量。 Speed:在除去蛋白酶的過程中此項非常關(guān)鍵。 Recovery:產(chǎn)品貴重時此項很重要。流動相的條件、環(huán)境會影響它。減少步鄹和保持一種對生物樣品合適的環(huán)境條件。 Resolution:在純化的最后階段，此項很關(guān)鍵，尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時。,七、分離機理和色譜

8、類型,分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時的分離依據(jù)： 疏水性 分子大小 等電點 結(jié)構(gòu)特異性,色譜介質(zhì)按分離機理分為,正相色譜： 反相色譜：常加入TFA 離子交換色譜：陰離子交換色譜（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺鹽）陽離子交換色譜（CM羧甲基S磺酸基） 凝膠過濾色譜： 疏水色譜：苯基，辛基等。 金屬螯合色譜：鎳、銅等 親合色譜 :,第二節(jié) 分離方案的設(shè)計,What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the p

9、urity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be removed? What must be removed completely? What will be the final scale of purification? What are the economical constraints and what resources and equipment are available?,一、分離方法之間的組合 四步純化法： Prepara

10、tion: Capture:(Isolate,concentrate and stabilize) Intermediate purification:(Remove bulk impurities) Polishing:(Achieve final high level purity）,色譜之間的組合方案 AC、GF、IEX、HIC,二、分離條件的優(yōu)化 合適的溶劑強度:容量因子k 足夠的柱效N: 良好的分離選擇性:,當(dāng)柱過載時： 1 N和k都隨樣品負荷的增加而迅速地減小 2 流速對于塔板數(shù)N的影響大大地降低 3 通過增加柱長來有效地提高柱效，不宜通過降低柱壓（或流速）來達此目的,制備分離的兩

11、種途徑： 第一種，基本上同于分析型，進樣量不過載，利用大內(nèi)徑的柱，通過調(diào)整分離方程中的有關(guān)參數(shù)來達到分離的最佳化。在該法中往往利用小顆粒的填料（約10m）來制取少量價值高而難分離的物質(zhì)。 第二種，使用大粒度填料（50m）的大內(nèi)徑柱，在過載情況下制備相對大量的純物質(zhì)。當(dāng)值相當(dāng)大時（例如1.2），提高洗脫液的流速并不至于嚴重降低分離度，從而大大縮短分離時間。,三、制備型高效液相色譜常見問題及解決辦法,待分離成分呈單一主峰 不易分開的兩組分 目的組分含量少,待分離成分呈單一主峰,不易分開的兩組分,目的組分含量少,第三節(jié) 實驗條件的選擇,色譜柱的選擇與填裝 柱填料 流動相選擇 檢測器的選擇 儀器設(shè)備,

12、一、柱的選擇和裝填 柱： 不銹鋼柱： 200kg ，生物適應(yīng)性差 玻璃柱：1015kg 聚合物柱： 裝填： 當(dāng)粒度小于20m，用較大的勻漿罐濕法填裝。粒度大于30m時；利用輕敲柱外壁的干填法,二、柱填料,硅膠： 葡聚糖和瓊脂糖： 高分子聚合物：,顆粒大小,在很小的分離制備中，要求較高的N值，宜用小粒度的填裝柱。 當(dāng)很大時，用大顆粒填裝柱，對過載進樣是有好處。,三、洗脫劑,可利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離目的和要求的流動相的組成（如溶劑的配比，離子強度，pH等），將其直接或略加修改后用于制備分離 一般不采用梯度洗脫 選擇合適的溶劑溶解樣品 采用色譜純的試劑,四、儀器設(shè)備,對泵的精密度和準(zhǔn)

13、確度要求不高（ 0.01100mL/min ） 對檢測器的高靈敏要求不高 流路系統(tǒng)盡可能用惰性聚合材料 柱外效應(yīng)試驗結(jié)果影響較小,第四節(jié) 操作變量的確定,一、樣品的進樣量 宜注射低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度小體積的樣品。 樣品進樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長、流動相和固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關(guān)。,二、制備產(chǎn)率,產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。 不過載的柱子，k值較小時，產(chǎn)率較高。 用全孔填料時產(chǎn)率高于用薄殼型的。 對于值小的分離，宜利用小粒度（510m）填料的柱子；在較大時，使用較大顆粒、大內(nèi)徑的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，且價格便宜。 柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。 產(chǎn)率隨

14、柱長、流動相的流速的增加而增加。,三、回收率計算和純度鑒定,除去組分中的溶劑：熱的氮氣流吹，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。 純度：HPLC，TCL。 回收率：重量，活性。,第五節(jié) 應(yīng)用實例-蛇毒中溶栓組分的分離,制備型高效液相色譜的應(yīng)用,肽的分離 蛋白質(zhì)的分離 多糖的分離 核酸的分離,肽的分離： 常用方法為反相色譜和離子交換色譜 肽的保留時間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預(yù)測。 反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對反相色譜。 肽的檢測：UV200230nm，熒光檢測。,蛋白質(zhì)的分離,1填料：孔徑300500 2流動相 （1）pH 低pH使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，極性降低，與反相鍵合相的作用強。對大多蛋白質(zhì)

15、而言，使用pH2.53.5的流動相可以得到最好的分離。,（2）離子強度和離子對試劑 增加離子強度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作用，較高的離子強度（0.2）可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率。 緩沖液中的鹽還能通過形成離子對改變蛋白質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），復(fù)合離子對保留時間增長。如果反離子是親水的（如磷酸根、甲酸根），則復(fù)合離子對保留時間減少。,（3）有機溶劑 有機溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手段之一。較常用的有乙腈和丙醇。 使用復(fù)合溶劑（如異丙醇-乙醇、乙腈-異丙醇等）可降低有機溶劑總濃度并改善分辨率及回收率。,（4）表面活性劑 兩性離子表面活性劑可以減少高分子量、疏水性較強的蛋白質(zhì)的拖尾，使分離得以改善。 （5）溫度 為了防止蛋白質(zhì)的不可逆變性和失活，分離一般在室溫或低溫下進行。,三、多糖的分離 分離：高效體