大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化.ppt

1、實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化,【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的原理與技術(shù)。 學(xué)習(xí)大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)。,【實(shí)驗(yàn)原理】 在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。 如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。,轉(zhuǎn)化(T

2、ransformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其原理是細(xì)菌處于0的CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)菌表面，經(jīng)42短時(shí)間熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。,轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)

3、基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。 CaCl2法是目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法，簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)。,本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pUCm-T質(zhì)粒（T-載體）共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUCm-T質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pUCm-T，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已

4、導(dǎo)入了pUCmT。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。,【設(shè)備、材料與試劑】 一、 設(shè)備恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，無菌工作臺(tái)，低溫冰箱， 恒溫水浴鍋， 制冰機(jī)， 分光光度計(jì)，微量移液槍。 二、 材料 E. coli DH5菌株: R,M,Amp；pUCmT質(zhì)粒DNA: 購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。,三、試劑 1. LB固體和液體培養(yǎng)基2. Amp母液3. 含Amp的LB固體培養(yǎng)基4. SOC液體培養(yǎng)基5. 0.1mol/L CaCl2溶液,【實(shí)驗(yàn)步驟】 一、 受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于20 ml LB

5、液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)至OD600 0.5左右。,二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法) 1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10-30分鐘，然后于4下5000 rpm離心10分鐘。 2、 棄上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置10分鐘后，4下5000 rpm離心10分鐘，棄去上清。 3、每50 ml初始培養(yǎng)物用200 l預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液重懸每份細(xì)胞沉淀，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

6、,三、 轉(zhuǎn)化 1、取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至無菌的微量離心管中，置冰上。2、加入連接產(chǎn)物10l，輕輕搖勻，冰上放置60分鐘。3、42水浴中熱擊2分鐘，熱激后迅速置于冰上冷卻2分鐘。4、向管中加入800 l SOC液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37振蕩培養(yǎng)30分鐘，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。（其間可以將IPTG 7l和X-Gal 40 l涂布于預(yù)制的Amp平板上）。,5、將上述菌液以3000 rpm離心20秒，棄大部分上清，用剩余的100l上清重懸菌體，涂布于含Amp的篩選平板上（已涂布IPTG 7l和X-Gal 40 l），正面向上放置半小時(shí)

7、,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時(shí)。 同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照: 對(duì)照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。對(duì)照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。,附錄： LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 酵母提取物0.5 NaCl 1 用NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1L，滅菌。 含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。,【注意事項(xiàng)】 為了提

8、高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： 1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。,2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。,3、試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新