第八章 抗生素

1、,第八章 抗生素類藥物的分析 （Antibiotics）,.,第一節(jié)：概述,1、定義：抗生素是某些微生物的代謝產(chǎn)物或合成 的類似物，在小劑量的情況下能抑制微生物的生長(zhǎng) 和存活，而對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性。,2、特點(diǎn)：由生物體產(chǎn)生或人工合成 化學(xué)純度低 結(jié)構(gòu)、組成復(fù)雜 對(duì)他種生物體有抑制作用,3、名稱演變：抗生素抗菌素抗生素 60-70年 80年后,.,一、抗生素類藥物一般檢查項(xiàng)目： 鑒別試驗(yàn): 用化學(xué)法、物理化學(xué)法以及生物學(xué)法來確認(rèn)是哪種抗生素 毒性試驗(yàn): 控制藥品中的毒性物質(zhì) 無菌試驗(yàn): 檢查藥品中有無雜菌污染 熱源試驗(yàn): 控制藥品中的致熱物質(zhì),.,水分測(cè)定: 控制水分含量 溶液澄明度檢查:

2、 檢查不溶性物質(zhì) 溶液pH試驗(yàn): 測(cè)定pH 降壓試驗(yàn): 檢查有降壓作用的雜質(zhì) 效價(jià)測(cè)定: 有效成分測(cè)定,.,抗生素藥品分析常用的方法：,物理方法:旋光法、紫外、紅外、色譜等 化學(xué)方法（專屬性不強(qiáng)）：功能團(tuán)反應(yīng)，鑒別和含量的測(cè)定。容量分析法：酸堿滴定（青霉素含量測(cè)定）和碘量法。 生物學(xué)方法：酶反應(yīng)、微生物法測(cè)定效價(jià),.,第二節(jié) 抗生素類藥物的鑒別,鑒別方法：,理化方法 生物學(xué)法：微生物法,官能團(tuán)顯色： 內(nèi)酰胺環(huán) 光譜法：UV、IR 色譜法:TLC、HPLC,.,根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類： 內(nèi)酰胺類抗生素：青霉素、頭孢菌素 氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素 四環(huán)素類：四環(huán)素、金霉素 大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、麥迪霉

3、素 多稀大環(huán)類：兩性霉素 多肽類：多粘菌素 苯烴胺類：氯霉素 蒽環(huán)類：阿霉素 其他：,抗生素類藥物的分類,.,.,一、-內(nèi)酰胺抗生素的結(jié)構(gòu)特征,指分子中含有由四個(gè)原子組成-內(nèi)酰胺環(huán) 是該類抗生素發(fā)揮生物活性的必需基團(tuán) 和細(xì)菌作用時(shí)，內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)與細(xì)菌發(fā)生酰化作用 抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。 因-內(nèi)酰胺由四個(gè)原子組成，分子張力較大，化學(xué) 性質(zhì)不穩(wěn)定易發(fā)生開環(huán)導(dǎo)致失活。,.,二、分類：經(jīng)典結(jié)構(gòu)藥物,.,分類：非典型結(jié)構(gòu)藥物,.,性質(zhì)1 ：酸性,分子中游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性，能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿形成鹽。 其堿金屬鹽易溶于水，而有機(jī)堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。,.,性質(zhì)2 ：旋光性,青霉素族分子中含

4、有三個(gè)手性碳原子，頭孢菌素族含有兩個(gè)手性碳原子，故都具有旋光性。 根據(jù)此性質(zhì)，可用于定性和定量分析。,.,性質(zhì)3 ：紫外吸收特性,1、青霉素類 母核無明顯UV 多數(shù)有苯環(huán)取代基,.,性質(zhì)4 ：不穩(wěn)定性,干燥條件下青霉素鹽穩(wěn)定。青霉素水溶液在 pH6-6.8時(shí)較穩(wěn)定。 -內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定的部分。,四元環(huán)張力大,酰胺鍵易水解,不穩(wěn)定性因素,、羥胺,.,例,青霉素的降解反應(yīng),青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑?；u胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,例,.,（一）色譜法,1、TLC法,對(duì)照品對(duì)照法,

5、2、HPLC法,二、鑒別試驗(yàn),.,頭孢氨芐 max = 262nm,青霉素V鈉 A280nm/A264nm = 1.301.50,2紫外分光光度法(UV),（二）光譜法,1、IR法,.,.,2、,IR法,3180cm-1 酰胺N-H,1780cm-1 內(nèi)酰胺 C=O,3470cm-1 酚羥基O-H,1690cm-1 仲酰胺C=O,1250cm-1 酚羥基C-O,以阿莫西林為例,.,-內(nèi)酰胺環(huán),酰胺,羧基,.,（三）茚三酮反應(yīng),某些具有-氨基的本類藥物，如氨芐西林，遇茚三酮即顯藍(lán)紫色。,.,-氨基、伯胺 某些羥基胺類,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,縮合,藍(lán)紫色,.,（四）各種鹽的反應(yīng),青霉素族、

6、頭孢菌素族藥品中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用其火焰反應(yīng)進(jìn)行鑒別。,1.火焰反應(yīng),.,三、特殊雜質(zhì)的檢查,本類抗生素的特殊雜質(zhì)主要有高分子聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測(cè)定雜質(zhì)的吸收度來控制雜質(zhì)量的。,.,（二）有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體 例：頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查（反相HPLC法） 取本品，流動(dòng)相，成0.4mg/ml，得供試液 供試液，流動(dòng)相，成4ug/ml，得對(duì)照液 對(duì)照品，流動(dòng)相，成4ug/ml，得雜質(zhì)對(duì)照液 雜質(zhì) ，外標(biāo)法。 其他雜質(zhì)，主成分自身對(duì)照法。 頭孢氨芐以青霉素鉀為原料，經(jīng)氧化、擴(kuò)環(huán)、裂解得7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA），再

7、與側(cè)鏈a-苯甘氨酸縮合而成。這兩種原料有可能成為主要雜質(zhì)。,.,（三）雜質(zhì)吸收度的檢查 例：青霉素鈉（鉀） 取本品，加水，成1.80mg/ml。 A280nm 控制雜質(zhì)不得大于0.10， A264nm 控制青霉素鈉（鉀）的含量應(yīng)為0.80-0.88 。,.,（四）有機(jī)溶劑,氨芐西林鈉：CH2Cl2 GC 頭孢哌酮：丙酮 GC 頭孢他啶：吡啶 HPLC,.,四、含量測(cè)定,青霉族和頭孢菌素族的含量測(cè)定大多采用理化測(cè)定方法中的HPLC法,特點(diǎn) 快速、高效、靈敏 專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好 一法多用（鑒別、檢查、含測(cè)）,.,哌拉西寧 原料藥 含量測(cè)定 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇0.2mo

8、l/L磷酸二氫鈉溶液10氫氧化四乙基銨溶液水（400503547）用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5為流動(dòng)相。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。,.,二 氨基糖苷類抗生素,鏈霉素 雙氫鏈霉素 新霉素 卡那霉素 慶大霉素 巴龍霉素,.,鏈霉素,鏈霉胍 + 鏈霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,鏈霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,鏈霉胍,.,絳紅糖胺 + 脫氧鏈霉胺 + 加洛糖胺,絳紅糖胺,紫素胺,2-脫氧鏈霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,.,慶大霉素C復(fù)合物 慶大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 慶大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 慶大霉素C1a R、R1、R2=H 慶大霉素C2a R=CH

9、3 R1= R2=H 慶大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,.,多與硫酸成鹽,鏈霉素 3個(gè),慶大霉素 5個(gè),堿性中心,（一）堿性,（四）苷的水解與穩(wěn)定性,鏈霉素 pH57.5 慶大霉素 pH212,鏈霉素在230nm處有吸收， 慶大霉素、奈替米星無,.,.,羥基胺結(jié)構(gòu),硫酸慶大霉素鑒別(1) 取本品約5mg ，加水1ml 溶解后，加0.1 茚三酮的水 飽和正丁醇溶液1ml 與吡啶 0.5ml，在水浴中加熱5 分 鐘，即顯紫藍(lán)色。,.,（二）Molisch反應(yīng),具五碳或六碳糖的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸（或硫酸）作用下脫水生成糠醛或羥甲基糠醛。這些產(chǎn)物遇-萘酚或蒽酮呈色。,紅紫色,

10、.,蒽酮呈色原理：,藍(lán)紫色,阿米卡星鑒別 (1) 取本品約10mg，加水1ml 溶解后，加0.1 蒽酮的硫酸溶液4ml ，即顯藍(lán)紫色。,.,吡咯衍生物,紅色,（Elson-Morgan反應(yīng)）,H+,.,鏈霉糖特有反應(yīng),.,紫紅,麥芽酚,.,鏈霉胍特有反應(yīng),（或-萘酚）,8-羥基喹啉, -萘酚,.,H+,光譜法,（八）,慶大霉素?zé)oUV吸收,.,鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）,方法 TLC中的對(duì)照品法 （BP）,1. 來源 反應(yīng)中間體,.,發(fā)酵菌種不同 工藝差別,規(guī)定控制各組分的相對(duì)百分含量 HPLC,ChP USP BP JP,.,max = 330nm,1.衍生化原理,1-烷基硫代-2-烷基 異吲哚

11、衍生物,.,RPHPLC,規(guī)定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面積歸一化法,.,.,鏈霉素、慶大霉素,微生物檢定法 本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用量反應(yīng)平行線原理的設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。,.,離子交換色譜法 離子對(duì)色譜法 RP-HPLC法,HPLC法,.,.,苯并蒽環(huán)結(jié)構(gòu),C-4為結(jié)構(gòu),是由放線菌產(chǎn)生的,天然有,一、天然四環(huán)素結(jié)構(gòu)特點(diǎn),R1 R2 R3 R4 四環(huán)素 H OH CH3 H 53年得到 土霉素 OH OH CH3 H 50年得到 金霉素 H OH CH3 Cl 48年

12、得到,.,二、作用：廣譜抗生素，G+、G-、部分立克 次體、病毒、原蟲等,近年來四環(huán)素類抗生素新藥開發(fā)不理想,三、作用機(jī)制:干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的生物合成 與細(xì)菌中的Mn+形成金屬離子絡(luò)合物,.,四、理化性質(zhì)：黃色結(jié)晶性粉末,1、酸堿兩性：Ar10-OH、=C3-OH為酸性 C4 N= 為堿性?？扇芩釅A 臨床用其堿，成HCl鹽,.,2、穩(wěn)定性：,.,2)pH2-6,C-4二甲胺基易發(fā)生差向異構(gòu)化,失活,.,3)OH-下C環(huán)開裂,失活,.,五、臨床用缺點(diǎn)：耐藥性嚴(yán)重 吸收不好，血藥濃度低 影響骨骼生長(zhǎng),孕婦及兒童為何不可用四環(huán)素：牙齒變黃、骨骼生長(zhǎng)抑制,4) 和金屬離子的反應(yīng),含OH、C=O、=C-O

13、H等基團(tuán)，可與Mn+生成不溶 性螯合物,如成Ca、Mg、Fe鹽等,生成不同色,.,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黃色,.,脫水四環(huán)素,.,TC,ETC,ATC,EATC,.,.,.,1mol/L鹽酸-甲醇（1100） 0.01mg/ml,UV法,（二）,（三）熒光法,.,HPLC法,（五）,EDTA 克服痕量金屬造成的 拖尾現(xiàn)象,（六） IR 法,硅藻土做載體,.,HPLC法,自身稀釋對(duì)照法,鹽酸四環(huán)素,.,.,雜質(zhì)吸收度,.,HPLC法（外標(biāo)法）,.,第五節(jié) 抗生素類藥物中高分子 雜質(zhì)的檢查,1.高分子雜質(zhì) 分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱。,.,蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 藥物的自身聚合物，來自于生產(chǎn)、貯存過程。可引發(fā)過敏。,外源性雜質(zhì),內(nèi)源性雜質(zhì),.,.,.,.,3.高分子雜質(zhì)的質(zhì)控方法（1）凝膠色譜法測(cè)定高分子雜質(zhì)：使高分子雜質(zhì) 與藥物分離。（2）高分子雜質(zhì)的控制方法-自身對(duì)照外標(biāo)法 原理：測(cè)定在Kav=0處 藥物締合物的峰響應(yīng) 指標(biāo) 樣品中高分子雜質(zhì)的響應(yīng)指標(biāo) 按外標(biāo)法計(jì)算，得樣品中高分子雜質(zhì) 相當(dāng)于藥物本身的相對(duì)含量。,.,（3）高分子雜質(zhì)的分析方法簡(jiǎn)單測(cè)定系統(tǒng)：葡聚糖凝膠G-