免疫共沉淀原理及注意事項(xiàng).ppt

1、免疫共沉淀,（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）,單系金,一 實(shí)驗(yàn)原理,以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。,問題：細(xì)胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？,Y-X-抗X,CO-IP應(yīng)用與IP區(qū)別,測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合 確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔 CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）,實(shí)驗(yàn)基本原理,1.提取蛋白 2.在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗

2、體 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物：“YX抗X抗體Protein A或G 3.經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（xy抗原、x抗體）,proteinA/G有一個(gè)很重要的特性就是能與抗體的Fc段結(jié)合,agarose bead 瓊脂糖珠,CO-IP原理圖解,proteinA/G-瓊脂糖珠復(fù)合物,Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合。 目前多用protein A/G預(yù)先結(jié)合在argarose beads上。,ProteinA/

3、G的作用及具體原理,“捕獲”抗體，形成復(fù)合物， 抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價(jià)健結(jié)合 ProteinA/G-garose beads 共價(jià)結(jié)合 加樣緩沖液-煮沸變性-離心 Protein A/G beads EP管（抗體-目的蛋白-少量非特異性吸附蛋白）。,二 CO-IP特征,優(yōu)點(diǎn) （1 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài) （2 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響 （3 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物,二 CO-IP特征,局限性 （1 可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用 （2 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，

4、有第三者在中間起橋梁作用； （3 必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。,三 實(shí)驗(yàn)流程,提取細(xì)胞總蛋白 離心，上清電泳(抗原抗體) 準(zhǔn)備PA珠子，PBS洗3遍 PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景) 離心去PA珠子，取上清 測(cè)蛋白濃度 (BCA法) 加一抗反應(yīng)(4過夜) 加PA珠子捕捉復(fù)合物 (室溫1h或4過夜) 離心，收集沉淀，預(yù)冷RIPA Buffer洗3遍 上樣緩沖液懸浮沉淀，加熱游離抗原、抗體、珠子 ,四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,SDS-PAGE Western blotting分析 質(zhì)譜分析檢測(cè)目的蛋白,SDS-PAGE結(jié)果分析,標(biāo)難曲線

5、只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。,以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。,一抗,一抗,一抗(兔抗Actin),曝光后的蛋白條帶,二抗 (辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG),ECL,X光片曝光顯影,ECL 試劑,含有轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF膜,+,+,轉(zhuǎn)印膜上蛋白檢測(cè)示意圖,WB結(jié)果分析,CO-IP與質(zhì)譜分析流程,三 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,1. 實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。 2. 為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3. 考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則

6、就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 4. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。？,注意的問題：1.裂解液,細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。,RIPA裂解液-普利萊基因技術(shù)有限公司,100ml RIPA Buffer： 50 mM Tris-HCl

7、 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（100元） 說明： 1. 裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為1mM的PMSF或其它蛋白酶抑制劑。 2. RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法測(cè)定蛋白濃度,裂解液成分,國(guó)內(nèi)博士： 細(xì)胞裂解液： 50mM Tris-HC（lpH7.5）， 150 mM NaCl, 0.5%NP-40, 1mM EDTA 使用前加入PMSF至終濃度1mM、 proteinase inhibitor cocktail（混合物）。 劉巖 BC300 buffer 20

8、mM Tris-Cl, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 10% glycerol（甘油）, 0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20,2.1免疫沉淀中抗體的選擇,注意的問題：2.2抗體,使用對(duì)照抗體：（陰性和陽性） 陰性：?jiǎn)慰寺】贵w：同一種屬的IgG 兔多克隆抗體：正常兔IgG 陽性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）,未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少,可能原因 處理方法 1.樣品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4以下冰上操作并防止凍融 2.抗體濃度太低：調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度 3.抗抗體親合力太低： 選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體 4.IP抗體未與agarose珠子結(jié)合： 選用適合于IP的相應(yīng)珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：改變tag融合表達(dá)部位 6.裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高： 改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液,目得蛋白高背景：,可能原因 處理方法 非特異蛋白結(jié)合 在無血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗， 免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑） 裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低 改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液 實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染 使用潔凈的儀器或液體 轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附 戴手套， 用鑷子夾取， 不要接觸膜轉(zhuǎn)移面,試劑,RIPA