β半乳糖苷結(jié)合凝集素9真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定.doc

半乳糖苷結(jié)合凝集素9真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定作者：邱文洪吳麗娜葉許楚娟易路陽郭凱文【摘要】目的：構(gòu)建半乳糖苷結(jié)合凝集素9的真核表達(dá)載體并鑒定。方法：通過DNA重組技術(shù)和PCR方法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞克隆半乳糖苷結(jié)合凝集素9基因，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，通過PCR、酶切及測序鑒定重組載體的正確性。結(jié)果：DNA測序和酶切鑒定證明半乳糖苷結(jié)合凝集素9基因正確克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位點(diǎn)。結(jié)論：成功構(gòu)建半乳糖苷結(jié)合凝集素9的真核表達(dá)載體pGal9?！娟P(guān)鍵詞】Gal9；構(gòu)建；真核表達(dá)載體半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成員參與了許多生理和病理過程，包括細(xì)胞間黏附、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、RNA轉(zhuǎn)錄后加工、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的凋亡等1，2。半乳糖苷結(jié)合凝集素9(Gal9)是一種糖結(jié)合蛋白，屬于半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成員，組織分布廣泛，在介導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、黏附、細(xì)胞間聚集、炎癥反應(yīng)的調(diào)控和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面，發(fā)揮著重要作用3。目前對Gal9發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍知之甚少，值得進(jìn)一步深入探討和研究，從而使Gal9作為疾病治療的新的靶點(diǎn)成為可能。為此，本研究擬通過構(gòu)建表達(dá)人Gal9蛋白的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Gal9的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料T4連接酶、限制性內(nèi)切酶(MBI)，Taq酶和RT試劑盒(Promega)，RNA提取試劑盒(Invitrogen)，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒(Qiagen)，DNAmarker(Tiangen)，Trizol、1640培養(yǎng)基，人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin9引物(英駿生物技術(shù)有限公司)。1.2引物設(shè)計(jì)參照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列設(shè)計(jì)引物如下:上游引物:P15CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA3，下游引物:P25CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC3，下劃線分別為Hind和EcoR酶切位點(diǎn),擴(kuò)增Gal9的CDS序列,共1176bp。1.3分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞靜脈取血，加入肝素溶液(1050u/m1血樣本)抗凝，用pH7.2Hanks液將抗凝血稀釋1倍；吸取人淋巴細(xì)胞分離液置于刻度離心管中，加入稀釋的全血；2000r/min離心20min；吸取所有單個(gè)核細(xì)胞，用Hanks液洗滌細(xì)胞3次。將單個(gè)核細(xì)胞離心收集備用。1.4單個(gè)核細(xì)胞總RNA的制備、RTPCR及克隆入載體pcDNA3.1(+)將離心收集的單個(gè)核細(xì)胞1105加入Trizol1mL，混勻，室溫5min；加0.2mL氯仿，渦旋15s，412000g，離心10min，吸取上清液至另一1.5mLEppendorf管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，放置10min，412000g，離心10min，去上清液，加入1mL預(yù)冷的濃度為750mL/L乙醇，充分混勻振蕩，412000g，離心10min，去上清液，充分干燥，用50L含1mL/LDEPC的ddH2O溶解沉淀，獲得細(xì)胞總RNA。取5L總RNA，按RTPCR試劑盒推薦方法以oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。取2l逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,加入10mMdNTP1.5ml,10PCR緩沖液5m,l50mMMgSO41m,l兩引物各10pmo,l補(bǔ)水至50m,lPCR反應(yīng)條件為:95預(yù)變性5min，94變性15s，55退火30s，72延伸1min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，72延伸10min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。按照WizardPCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書純化，回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)Hind和EcoR雙酶切，定向插入表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的相應(yīng)位點(diǎn)。該質(zhì)粒命名為pGal9，經(jīng)PCR、Hind和EcoR雙酶切及測序鑒定序列的正確性。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Prism4.0軟件行單因素方差分析，以及組間比較。P<；0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1Gal9的RTPCR擴(kuò)增從單個(gè)核細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，以此為模板，應(yīng)用前述引物進(jìn)行RTPCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖電泳中，可見分布于Marker1.01.5kb的特異條帶，與預(yù)計(jì)長度1176bp相符(圖1)。2.2真核質(zhì)粒pGal9構(gòu)建和鑒定將RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)Hind和EcoR雙酶切后，克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)。陽性克隆送英駿公司測序，同時(shí)進(jìn)一步對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。以陽性重組質(zhì)粒為模板，用前述特異性引物進(jìn)行PCR，可擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)長度1176bp相符的目的片段，而空載體則為陰性結(jié)果(圖2A)。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)Hind和EcoR雙酶切后電泳，同樣可見與預(yù)計(jì)長度相符的片段(圖2B)。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增獲得并克隆的Gal9片段序列與GenBank中的序列完全一致(結(jié)果未附)。1Marker；2RTPCRproductofGal9gene圖1RTPCR擴(kuò)增Gal9基因CDS序列APCRanalysis：1Marker；2PCRproductofpGal9；3PCRproductofpcDNA3.1(+)；BDoublerestrictionenzymedigestionanalysis：1Marker；2pcDNA3.1(+)dynamitindigestedwithHindandEcoR；3pGal9dynamitindigestedwithHindandEcoR。圖2真核表達(dá)質(zhì)粒pGal9的PCR和雙酶切鑒定3討論半乳糖凝集素家族(galectinfamily)是含有一個(gè)保守糖識(shí)別域的半乳糖苷結(jié)合凝集素。半乳糖凝集素家族有15名成員，廣泛參與許多生理和病理過程，包括細(xì)胞間黏附、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、RNA轉(zhuǎn)錄后加工、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的凋亡等1,2。半乳糖苷結(jié)合凝集素9(Gal9)是一種糖結(jié)合蛋白，屬于alectin家族成員，組織分布廣泛，具有多種生物學(xué)活性，參與細(xì)胞聚集和粘附、增殖、死亡和調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)等多種生理和病理過程3。為進(jìn)一步研究Gal9的作用機(jī)制，我們通過DNA重組技術(shù)和PCR方法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞克隆Gal9基因，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建了包含Gal9基因的真核表達(dá)載體pGal9。為鑒定真核表達(dá)載體pGal9，以陽性重組質(zhì)粒為模板，用前述特異性引物進(jìn)行PCR，證明獲得的真核表達(dá)載體pGal9可擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)長度1176bp相符的目的片段，而空載體則未見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。獲得的真核表達(dá)載體pGal9經(jīng)Hind和EcoR雙酶切后電泳，同樣可見與預(yù)計(jì)長度相符的片段。測序結(jié)果證明，PCR擴(kuò)增獲得并克隆的Gal9片段序列與GenBank中的序列完全一致。通過上述實(shí)驗(yàn)可以證明我們成功構(gòu)建并獲得了包含Gal9目的基因的真核表達(dá)載體pGal9。在Gal9當(dāng)初被發(fā)現(xiàn)時(shí)，引人注意的是ECA活性4，然而隨著研究的不斷深入，Gal9越來越多的生物學(xué)功能被人們所了解，這使得人們對Gal9乃至整個(gè)galectin家族的興趣日益濃厚。研究發(fā)現(xiàn)，Gal9通過誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，抑制Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成，來改善小鼠自身免疫性疾病模型的嚴(yán)重性，如實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎(EAE)5和膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)6。相信今后的免疫學(xué)研究方向不僅關(guān)注于galectin家族的其他成員，還將對Gal9發(fā)揮作用的具體機(jī)制，尤其是對免疫系統(tǒng)的影響作進(jìn)一步深入探討，從而使Gal9作為免疫病理性疾病治療的新的靶點(diǎn)成為可能。綜上所述，我們成功克隆了能夠正確表達(dá)Gal9目的基因的真核表達(dá)載體pGal9，為進(jìn)一步研究的Gal9功能提供方便，并為進(jìn)一步探討Gal9對免疫系統(tǒng)的影響奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ElolaMT,WolfensteinTodelC,TroncosoMF,VastaGR,RabinovichGA.Galectins:matricellularglycanbindingproteinslinkingcelladhesion,migration,andsurvival.CellMolLifeSci,2007，64:1679700.2HasanSS,AshrafGM,BanuN.Galectinspotentialtargetsforcancertherapy.CancerLett,2007，253:2533.3HirashimaM,KashioY,NishiN,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalconditions.GlycoconjJ,2004，19:593600.4MitsuomiHirashima,YumikoKashio,NozomuNishi,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalConditions.Glycoconjugate,2004，19:593600.5AndersonAC,AndersonDE,BregoliL,etal.PromotionoftissueinflammationbytheimmunereceptorTim3expressedoninnateimmunecells.Sci