不同處理對(duì)大鼠移植心臟存活時(shí)間的影響.doc

不同處理對(duì)大鼠移植心臟存活時(shí)間的影響【摘要】目的觀察供體脾細(xì)胞（SPC）與環(huán)磷酰胺（CP）聯(lián)合預(yù)處理對(duì)大鼠移植心臟存活時(shí)間的影響。方法應(yīng)用大鼠頸部心臟移植模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（未干預(yù)組）、CsA組、SPCCP組。CsA組心臟移植后予環(huán)孢霉素A(CsA)10mg/kg，SPCCP組采用供體SPC和CP預(yù)處理移植受體，然后行大鼠頸部心臟移植術(shù)。觀察移植心臟存活情況及組織病理變化。結(jié)果對(duì)照組、CsA組、SPCCP組移植心臟存活時(shí)間分別為(7.22.4)、（15.84.3）、（30.410.7）天；組織病理檢查顯示，經(jīng)SPC+PC預(yù)處理的移植心臟排斥反應(yīng)明顯減弱。結(jié)論SPC和CP預(yù)處理可以誘導(dǎo)受體對(duì)移植物的免疫耐受，延長(zhǎng)移植心臟的存活期，效果優(yōu)于CsA?！娟P(guān)鍵詞】心臟移植免疫耐受供體脾細(xì)胞環(huán)磷酰胺環(huán)孢霉素A大鼠Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectofpretreatmentwithdonorspleencells(SPC)andcyclophosphamide(CP)onthesurvivaltimeofcardiacallograft.MethodsTheexperimentwasperformedonSDratmodelsofheterotopiccervicalhearttransplantation.Theanimalsweredividedinto3groups.ThecontrolgroupconsistedofSDmodelswithouttreatment.InthecyclosporineA(CsA)drugcontrolgroup,therecipientsweretreatedaftertransplantationwithCsA10mg/kgipq2d.IntheSPC+CPpretreatmentgroup,theSDratswerepretreatedwithSPCivonD0andwithCP80mg/kgiponD2,andthetransplantationwascarriedoutonD10.Thelivingconditionandthesurvivaltimeoftheallograft,anditspathologywerenoticed.ResultsThesurvivaltimeinthecontrolgroup,CsAgroupandSPC+CPgroupwas(7.22.4),(15.84.3)and(30.410.7)respectively.HistopathologyshowedtheHVGrejectionreactionswereevidentlyattenuatedinthepretreatmenttestgroup.ConclusionPretreatmentwithSPCplusCPenablesthehosttoproduceimmunetolerancetothecardiacallograft,extendingthesurvivaltimeofthegraft,evenlongerthantheconventionalCsAtreatment.Keywords:cardiactransplantation；immunetolerance；pretreatment；donorspleencell；cyclophosphamide；cyclosporinA；rats器官移植在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，然而移植后排斥反應(yīng)卻嚴(yán)重阻礙著移植醫(yī)學(xué)的發(fā)展。本研究應(yīng)用大鼠異位心臟移植模型，采用門靜脈輸注供體脾細(xì)胞（donor-specificspleenocyts，SPC）及環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）注射誘導(dǎo)免疫耐受，對(duì)移植心臟的存活情況進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料健康近交系Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，816周齡，體質(zhì)量200250g，隨意進(jìn)食和飲水。質(zhì)量濃度1%的戊巴比妥鈉，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，25103U/L肝素，質(zhì)量濃度2的罌粟堿，顯微外科手術(shù)器械（上海醫(yī)療儀器廠），醫(yī)用無(wú)損傷縫線，套管，絲線。1.2方法1.2.1脾細(xì)胞懸液的制備取Wistar大鼠，1%戊巴比妥鈉按4ml/kg(40mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后，無(wú)菌開腹取脾。將脾臟制備成單細(xì)胞混懸液1，顯微鏡下計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞數(shù)量。1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理分為對(duì)照組、CsA組和SPCCP組，每組受體和供體各12只，受體為SD大鼠，供體為Wistar大鼠。對(duì)照組（未干預(yù)組）：受體不做任何預(yù)處理。CsA組：受體不做任何預(yù)處理，心臟移植手術(shù)當(dāng)日開始用環(huán)孢霉素A(CsA)10mg/kg，腹腔內(nèi)注射，每2天1次，共810次。SPCCP組：取受體SD大鼠，將制備好的供體脾細(xì)胞（SPC）5108個(gè)，自SD大鼠的門靜脈內(nèi)注入（d0），第2天(d2)SD大鼠的腹腔注射環(huán)磷酰胺（CP）80mg/kg；分別于第10天進(jìn)行心臟移植手術(shù)。1.2.3心臟移植方法采用套管法行大鼠頸部心臟移植，具體方法見文獻(xiàn)2。1.3觀察指標(biāo)1.3.1術(shù)后每日2次頸部視診或觸診，觀察移植心的博動(dòng)情況。1.3.2病理觀察:分別于術(shù)后第7、11天及終末期等時(shí)間點(diǎn)各取4只供心，送病理學(xué)檢查，采用蘇木精-伊紅染色方法制作病理切片。觀察移植心臟大體情況，切片觀察炎性細(xì)胞、心肌壞死、肉芽組織增生情況，判斷病理改變程度。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理大鼠移植心臟存活時(shí)間用s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1術(shù)后移植心臟觀察對(duì)照組（未干預(yù)組）術(shù)后移植心臟收縮有力、搏動(dòng)幅度較大、心率快慢不等，心率均慢于受體心率（300500次/min）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，移植心臟逐漸增大，收縮力明顯減弱，搏動(dòng)幅度降低，常在術(shù)后711天停跳。移植部位打開時(shí)見移植心臟周圍明顯水腫和滲出，但沒有膿液及明顯的感染征象。CsA組移植心臟的改變基本上也經(jīng)歷心臟搏動(dòng)由強(qiáng)到弱再好轉(zhuǎn)、心臟增大再縮小的過(guò)程，總趨勢(shì)與SPC+CP組相似，但在移植心臟功能最差時(shí)仍可觸及搏動(dòng)。SPCCP組移植心臟早期變化與對(duì)照組基本一致，出現(xiàn)收縮力逐漸減弱，搏動(dòng)幅度逐漸減小，移植心臟明顯增大，在711天時(shí)最為嚴(yán)重；本組約有1/41/3移植心臟常觸不到搏動(dòng)，僅可見頸部毛動(dòng)，個(gè)別需要麻醉后觀察，而此時(shí)切開頸部手術(shù)區(qū)皮膚后，可見移植心臟有較弱的收縮。此種狀況常在術(shù)后15天左右好轉(zhuǎn)，隨著頸部手術(shù)瘢痕的軟化，移植心臟開始縮小，心率逐漸增快，搏動(dòng)幅度和收縮力逐漸增加。有趣的是，在移植心臟功能最差時(shí)只要出現(xiàn)收縮力和搏動(dòng)幅度增加等好轉(zhuǎn)征象，便能夠長(zhǎng)期存活。在術(shù)后15天到1個(gè)月內(nèi)移植心臟明顯縮小，心率快慢不等，約有半數(shù)以上移植心臟出現(xiàn)心律不齊，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短不一，但均能自行好轉(zhuǎn)，有的可出現(xiàn)多次心律不齊，個(gè)別移植心臟心率比受體心率快。2.2移植心臟存活時(shí)間應(yīng)用CsA治療后，移植心臟的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，CsA組與對(duì)照組比較，差異顯著（P<；0.05），說(shuō)明CsA可以顯著延長(zhǎng)移植心臟的存活時(shí)間。SPC+CP組移植心臟的存活時(shí)間與CsA組比較，二者差異顯著（P<；0.05），說(shuō)明SPC+CP聯(lián)合預(yù)處理對(duì)預(yù)防移植心臟排斥反應(yīng)的效果優(yōu)于CsA。3組大鼠移植心臟存活時(shí)間見表1。表13組大鼠移植心臟存活時(shí)間比較2.3各組終末期移植心臟大體變化對(duì)照組：移植心臟體積增大，明顯充血、水腫。CsA組：移植心臟體積輕度增大，呈實(shí)性變，質(zhì)韌，充血、水腫不明顯。SPC+CP組：移植心臟增大不明顯，質(zhì)軟、紅潤(rùn)。2.4各組移植心臟組織病理學(xué)檢查術(shù)后7天、11天組織病理檢查見圖1。對(duì)照組：移植心臟的心肌壞死和細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多；浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞。CsA組：心肌壞死和細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。與對(duì)照組比較，浸潤(rùn)細(xì)胞中巨噬細(xì)胞明顯增加，而淋巴細(xì)胞明顯減少。3討論有報(bào)道稱通過(guò)門靜脈注射脾細(xì)胞，在不使用免疫抑制劑的情況下可以誘導(dǎo)完全異基因小鼠間的皮膚移植耐受3。通過(guò)門靜脈途徑給予同種異體抗原，可誘導(dǎo)供體特異性耐受，并且經(jīng)門靜脈輸注最為有效；其次為外周靜脈、腹腔；皮下最差。我們采用供體的脾細(xì)胞處理受體（d0），在第2天給予門靜脈注射CP5080mg/kg。在這種模型中，供體抗原和干細(xì)胞聯(lián)合治療對(duì)產(chǎn)生耐受是必需的，在注射供體抗原后，對(duì)供體抗原發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞被激活并進(jìn)行增殖，而增殖的細(xì)胞可被隨后給予腹腔注射的CP選擇性破壞4，抗原激活的T細(xì)胞首先從外周消失，隨后在外周和胸腺內(nèi)便出現(xiàn)了暫時(shí)的嵌合體狀態(tài)5-6，使得在外周7和胸腺內(nèi)8對(duì)供體反應(yīng)的免疫細(xì)胞發(fā)生克隆丟失。由此可見，來(lái)源于供體的骨髓成分在胸腺髓質(zhì)中生存導(dǎo)致了與移植物起反應(yīng)的胸腺細(xì)胞不斷缺失。在這種模型中，移植耐受的維持是胸腺水平與移植物發(fā)生反應(yīng)T細(xì)胞持續(xù)缺失的結(jié)果?？寺G失與移植耐受的作用是克隆無(wú)反應(yīng)性伴有某種程度的細(xì)胞程序性死亡的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SPC+CP誘導(dǎo)的免疫耐受進(jìn)行了研究，即用SPC通過(guò)門靜脈注射，2天后給予80mg/kg的CP。因?yàn)樵谳斪愺w抗原后，受體內(nèi)的T細(xì)胞在13天內(nèi)增殖活躍，此時(shí)用藥容易殺死增殖的T細(xì)胞，造成克隆排除9，因此，我們選擇SPC注射后2天作為CP用藥的最佳時(shí)間。10天后進(jìn)行心臟移植，結(jié)果移植物的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。病理檢查結(jié)果中，經(jīng)SPC+CP處理后，移植心臟炎癥反應(yīng)、心肌壞死及肉芽組織增生情況較CsA組、對(duì)照組輕，說(shuō)明該法誘導(dǎo)免疫耐受效果良好。采用SPC+CP預(yù)處理后，我們觀察到大部分移植心臟在手術(shù)后均逐漸增大，搏動(dòng)幅度逐漸降低，頻率也有減慢，而在711天之后，增大的移植心臟開始縮小，隨著傷口周圍瘢痕的軟化，移植心臟搏動(dòng)幅度漸增大，頻率也加快，自此以后移植心臟可以長(zhǎng)期存活。本組術(shù)后存活至12個(gè)月的移植心臟通?？s小至手術(shù)時(shí)大小。而在對(duì)照組中，移植心臟早期的變化與SPC+CP組基本相同，但增大更明顯，搏動(dòng)幅度降低，頻率漸減慢，常在711天完全停跳(沒有好轉(zhuǎn)征象)，移植心臟周圍常有明顯水腫滲出，心肌也有腫脹、充血，顯微鏡下可見到心肌細(xì)胞壞死，少數(shù)水腫明顯者切口愈合欠佳，縫線處的皮膚裂開。在急、慢性排斥反應(yīng)模型中，移植心臟的早期變化有許多相似之處，僅根據(jù)頸部心臟觀察情況很難對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。但急性排斥反應(yīng)時(shí)移植心臟增大、炎癥水腫常更明顯，且至停跳時(shí)無(wú)好轉(zhuǎn)征象，而SPC+CP組雖然搏動(dòng)幅度和頻率逐漸減低，但后來(lái)漸好轉(zhuǎn)，可以長(zhǎng)期存活。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPC+CP預(yù)處理誘導(dǎo)免疫耐受效果良好，能夠明顯延長(zhǎng)大鼠同種異體心臟移植的存活時(shí)間，效果優(yōu)于CsA?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1郭宏偉，吳清玉，謝蜀生，等.多次輸注供體脾細(xì)胞誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究J.中華外科雜志，2004，42(11):664-667.2張偉，張中明，錢偉民，等.大鼠頸部心臟異位移植模型的建立J.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28（6）：360-363.3MoritaH，SugiuraK，InabaM，etal.AstrategyfororganallograftswithoutusingimmunosuppressantsorirradiationJ.ProcNatlAcadSciUSA,1998，95(12):6947-6952.4MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Directevidenceforclonaldestructionofallo-reactiveTcellsinthemicetreatedwithcyclophosphamideafterallo-primingJ.Immunology,1993，78(1):113-121.5MayumiH，HimenoK，ShinT，etal.Drug-inducedtolerancetoallograftsinmice.ToleranceinductioninH-2-haplotype-identicalstraincombinationsinmiceJ.Transplantation,1985，40(2):188-194.6MayumiH，GoodRA.Inductionoftoleranceacrossmajorbarriersusingatwo-stepmethodwithgeneticanalysisoftoleranceinductionJ.Immunobiology,1989，179(1):86-108.7MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Roleofperipheralhemopoieticchimerisminachievingdonor-specifictoleranceinadultmiceJ.JImmunol,1993，150(3):753-762.8EtoM，