硫酸銨分級(jí)純化蛋白質(zhì)原理操作.doc

硫酸銨分級(jí)純化蛋白質(zhì)原理操作 硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)原理與操作一， 基本原理 硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。 二， 試劑及儀器 1 . 組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等 2. 硫酸銨（ NH 4 ） SO 4 3. 飽和硫酸銨溶液（ SAS ） 4. 蒸餾水 5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 ) 6. 透析袋 7. 超速離心機(jī) 8. pH 計(jì) 9. 磁力攪拌器 三， 操作步驟 以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸 銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% 50% 。 （一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ） 1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升 蒸餾水中。用氨水或硫酸調(diào)到硫酸pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液（ 4.1 mol/L, 25 C ）. 2.其它不同飽和度銨溶液的配制 （二）沉淀 1.樣品（如腹水） 20 000 g 離心 30 min ，除去細(xì)胞碎片； 2.保留上清液并測量體積； 3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中，終濃度為 1 ： 1 （ 4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時(shí)或攪拌過夜（ 4 C ），使蛋白質(zhì)充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白質(zhì)溶液 10 000 g 離心 30 min （ 4 C ）。棄上清保留沉淀； 2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對(duì) PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時(shí)（ 4 C ），每隔 3-6 小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨； 3.透析液離心，測定上清液中蛋白質(zhì)含量。 四，應(yīng)用提示 （一） 先用較低濃度的硫酸氨預(yù)沉淀，除去樣品中的雜蛋白。 1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中，使?jié)舛葹?0.5:1 (v/v) ； 2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時(shí) 或過夜（ 4 C ）；3.3000 g 離心 30 min （ 4 C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時(shí)，用預(yù)沉淀除雜蛋白是非常有效 （二）