引物延伸分析(primerextensionanalysis)

1、引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5端作圖。poly（A）+RNA首先與過量5端標(biāo)記的且與靶RNA互補的單鏈寡核苷酸引物雜交，然后用反轉(zhuǎn)錄酶延伸這個引物。產(chǎn)生的cDNA與RNA模板互補且長度與引物5端和RNA 5端之間的距離相等。該法在mRNA 5端作圖方面具有下述優(yōu)勢：一旦引物被子起始合成，延伸反應(yīng)大多會進行到RNA模板的5最末端，產(chǎn)物大小可精確測定。此外，產(chǎn)物長度不會受靶基因內(nèi)含子分布與大小的影響。幾乎所有的引物延伸實驗多采用長2030 bp合成寡核苷酸引物。當(dāng)用于和靶序列雜交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5端150 bp以內(nèi)時，可獲得最佳

2、結(jié)果。在更遠距離處雜交的引物能增加異源延伸產(chǎn)物，因為反轉(zhuǎn)錄酶會在模板RNA的二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜區(qū)終止。因此，在設(shè)計引物時，除實際的序列之外還應(yīng)考慮到雜交的位置。應(yīng)盡可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3端為G或C。用兩個引物在mRNA相距一段已知距離（2050 bp）的區(qū)域上分別雜交則更為理想。大小差別等于兩個引物間距的延伸產(chǎn)物，可對結(jié)果進行驗證。為了找到一對能產(chǎn)生明確延伸產(chǎn)物的引物，合成多個引物也許是必須的。在很多情況下，引物延伸反應(yīng)會產(chǎn)生兩個產(chǎn)物：全長cDNA分子和短22 bp的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這可能代表著多個轉(zhuǎn)錄起始位點導(dǎo)致的mRNA 5端不均一性。有時，在臨近靶mRNA 加帽位點的甲基化殘基

3、處的提前終止將產(chǎn)生更短的產(chǎn)物。與帽子結(jié)構(gòu)相關(guān)的條帶在不同mRNA 樣品中的化學(xué)定量是不同的，對于一份給定樣品總是一個定值。為了區(qū)分反轉(zhuǎn)錄假象和真正的mRNA 5端不均一性，用5端標(biāo)記的探針進行S1核酸酶分析是一個很好的方法。與未進一步分離的哺乳動物RNA相比，poly（A）+RNA樣品可得到干凈得多的結(jié)果，因為前者分產(chǎn)生多到不可接受的提前終止產(chǎn)物。通過在更高濃度（5 mmol/l）dNTP下進行延伸反應(yīng)，并在用互補區(qū)位于mRNA 5端50100 bp以內(nèi)的引物可將假象降至最低。用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化寡核苷酸引物一度是必須的。這些年來，除非總是產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的梯狀條帶，許多研究者已不再費心純化了

4、。在雜交反應(yīng)中，核苷酸引物分子的量應(yīng)大約10倍于靶mRNA。更多量的引物可能會導(dǎo)致非特異延伸和人為條帶的出現(xiàn)。所以，且一定量RNA與不同量的引物（通常為2040 fmol，104105 cpm）進行一系列預(yù)實驗是可取的。復(fù)性溫度極大地影響引物延伸實驗的質(zhì)量，值得在預(yù)實驗中調(diào)查以確定最佳復(fù)性溫度。多數(shù)情況下，對于GC含量為50%，2030 bp的引物，其最佳復(fù)性溫度在4060之間?？梢栽O(shè)置一系列以5為間隔的引物延伸反應(yīng)來確定最佳復(fù)性溫度。當(dāng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析延伸產(chǎn)物時，大小已知、末端標(biāo)記的DNA片段可用作相對分子質(zhì)量標(biāo)記參照物。但最好是采用與延伸反應(yīng)相同引物的基于DNA模板的測序圖，通過對

5、照測序圖讀出引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物的大小，靶RNA的5端可定位于一個特定的堿基。在研究啟動子區(qū)時往往采用引物延伸分析（primer extension analysis，看了些相關(guān)資料，感覺收獲不小，和大家分享一下。1、引物延伸分析（primer extension analysis）引物延伸分析用于定量mRNA的量，測定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實驗可標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5-端， 確定轉(zhuǎn)錄的精確起始。特異的末端標(biāo)記的引物退火到RNA鏈的互補區(qū)域，隨后用RNA作為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物得到cDNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長度為引物的標(biāo)記的核苷酸到RNA-5末端間的堿基

6、數(shù)，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 長度為20-40個核苷酸，與要分析的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5末端區(qū)域互補。延伸產(chǎn)物小于150個核苷酸，可得到最佳分離效果。引物延伸實驗非常靈敏，可檢測2 pg的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這相當(dāng)于1個細胞中的1個RNA。引物延伸實驗非常適合于對單個基因作定量和定性分析。（1）引物延伸分析所用試劑：引物延伸實驗需要模板RNA，可用總RNA或poly(A)+RNA。一個特異的末端標(biāo)記的核苷酸或DNA片段作為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。除RNA模板和標(biāo)記的引物，還需要反轉(zhuǎn)錄酶，AMV或MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)溶液、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑，和電泳裝置

7、。所得結(jié)果用放射自顯影和磷成像儀分析。 （2）引物延伸系統(tǒng)的組分：引物延伸系統(tǒng)中AMV反轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)溶液、焦磷酸鈉、正對照RNA模版和對照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子參照物、T4多核苷酸激酶和溶液、樣品溶液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2X溶液100 mM Tris-HCl（pH8.3, 42）、100 mM KCl、 20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一種dNTP、1 mM精胺。PhiX174標(biāo)準(zhǔn)分子參照物和T4 多核苷酸激酶用作引物標(biāo)記，和確定延伸產(chǎn)物長度的標(biāo)準(zhǔn)。對照RNA可得到87個堿基的延伸產(chǎn)物作為正對照。引物延伸反應(yīng)中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長cD

8、NA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。雖然其作用方式未確定，但結(jié)果是增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制，如使用MMLV，放線菌素D可用于增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成。 （3）引物延伸實驗的優(yōu)化：雜交溫度。引物延伸實驗中所用的雜交溫度是最關(guān)鍵的需優(yōu)化的因素。一般而言，最高緊密度，或引物和互補序列完全雜交所需的最適條件是，低于引物溶解溫度的5oC。低于最高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度。應(yīng)在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交，以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時，帶來的延伸

9、產(chǎn)物的丟失表明，引物和相關(guān)的卻不是等同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。在堿和雙價陰離子的存在下，RNA在較高溫度會降解，應(yīng)用甲酰胺雜交操作方案，這可有效降低溶解溫度，因此可使雜交在較低的溫度進行?？稍陔s交步驟中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用這個雜交溶液，延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。模板RNA和引物的量。以下討論了所用RNA模板和引物的起始量。反轉(zhuǎn)錄酶對不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級結(jié)構(gòu)干擾反轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活力。如產(chǎn)生短的產(chǎn)物，這通常不是一個問題。如用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，延伸溫度可達55。每次反應(yīng)所用RNA的量。每次反

10、應(yīng)所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類（總RNA或poly(A) + RNA），目的RNA的相對豐度。如用總RNA，起始量為10ug，但分析稀有信號，每次反應(yīng)用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反應(yīng)用0.1-1.0 ug，具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特異RNA的濃度。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整。通過凝膠分析總RNA，應(yīng)有完整的18S和28S核糖體RNA帶。在引物延伸反應(yīng)中用Northern印跡和RT-PCR分析來確定特定RNA的存在。 每次反應(yīng)所用引物的量。用引物延伸實驗定量RNA，標(biāo)記的引物必須多于目的RNA。引物應(yīng)是互補RNA

11、的5-10倍。但一般，總RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。對未分析的轉(zhuǎn)錄物，初次分析用50 ug總RNA和100fmol引物。如所有RNA中與引物互補的位點飽和，測試信號和投入的RNA的量成正比，而不依賴于引物的濃度。引物應(yīng)至少為20個核苷酸，雜交位點應(yīng)位于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5-末端下游的100個堿基處，而不會自互補。也可用從限制性酶切片段所得的ssDNA作為探針，長度應(yīng)不長于50-100個核苷酸，以獲得最佳分辨率。AMV和MMLV的選擇。引物延伸反應(yīng)通常用AMV，AMV性能更好，對次級結(jié)構(gòu)耐受。用AMV的延伸溫度可達55, 以消除次級結(jié)構(gòu)，但在這樣溫度下，引物延伸反應(yīng)的得率通常降

12、低。MMLV的最適溫度為37，在更高溫度下，MMLV不穩(wěn)定，但MMLV可合成更長的產(chǎn)物，這一特點對引物延伸反應(yīng)不適用，因引物延伸反應(yīng)所得的產(chǎn)物一般較短，為100-500個核苷酸。會導(dǎo)致非特異，短的和多個引物延伸產(chǎn)物的影響因子：所研究的轉(zhuǎn)錄的差異程度可導(dǎo)致產(chǎn)生不同長度的延伸產(chǎn)物，它們來源于選擇式剪切和使用不同的轉(zhuǎn)錄起始位點。差異核RNA的存在也能導(dǎo)致產(chǎn)生多個延伸產(chǎn)物。引物和RNA中相關(guān)或無關(guān)序列的交叉雜交也會導(dǎo)致非特異延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生。產(chǎn)物短于預(yù)測可能和RNA模板的降解有關(guān)，或者是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中次級結(jié)構(gòu)阻制了反轉(zhuǎn)錄酶的合成，產(chǎn)生斷缺的cDNA。RNA樣品中存在DNA污染同樣可得延伸產(chǎn)物，加放線菌素D（

13、75ug/ml）可抑制這類產(chǎn)物的產(chǎn)生。應(yīng)作無RNA模板的負(fù)對照實驗，以確定所用試劑中無RNA和DNA污染。同時還應(yīng)用從不表達目的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞或組織中提取的RNA模板作負(fù)對照實驗。 （4）計算RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量。RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量可對引物延伸產(chǎn)物，和無RNA對照實驗的cpm作測量得到。從凝膠中分別切割引物延伸產(chǎn)物和無RNA對照實驗中產(chǎn)物，在閃爍液中測定凝膠塊的讀數(shù)，可有效平衡聚丙烯酰胺凝膠的湮滅和32P的衰退。以下的例子表明如何計算fmol的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，在這個例子中，一半的引物延伸產(chǎn)物（20ul/40ul）加入凝膠中作分析。無RNA對照實驗的引物濃度為100 fmol，一

14、半的反應(yīng)液加入凝膠中作分析。切割的帶的讀數(shù)為：樣品為3912 cpm，引物為 cpm，首先計算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol= cpm/100 fmolX（20/40）=2847 cpm/ fmol，接下來計算引物延伸產(chǎn)物的fmol，或cDNA：3912 cpm/2847 fmolX（20/40）=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。 （5）確定引物延伸產(chǎn)物的精確長度的分子標(biāo)準(zhǔn)參照物。為確定引物延伸產(chǎn)物的精確長度，應(yīng)同同位素標(biāo)記的DNA分子標(biāo)準(zhǔn)參照物對照。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)參照物末端作了標(biāo)記，上變性凝膠前先作變性，引物延伸產(chǎn)物也作變性。長度在20-50

15、0核苷酸范圍的分子標(biāo)準(zhǔn)參照物在確定引物延伸產(chǎn)物的長度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子參照物非常方便，已去磷酸，可作5末端標(biāo)記，分子標(biāo)準(zhǔn)參照物的長度為24-726核苷酸。用于引物延伸產(chǎn)物分離的聚丙烯凝膠的規(guī)格為16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1TBE溶液。這種膠和測序膠很相似，故一般可用測序膠。應(yīng)注意不使引物延伸產(chǎn)物和自由引物跑到膠外，特別是需對cDNA定量時。2、核酸酶S1作圖（Mapping RNA with Nuclease S1）三種不同的核酸酶S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用來進行RNA定量，確定內(nèi)含子位置，及鑒定在的DNA模板上mRNA的5-末端和3-末端的位置。含有目的mRNA的RNA樣品與互補的DNA或RNA探針在利