HIV病毒檢測方法及其檢測試劑盒

1、.(54)發(fā)明名稱hiv病毒rt-lamp-lfd檢測方法及其檢測試劑盒(57)摘要本發(fā)明公開了一種hiv病毒rt-lamp-lfd檢測試劑盒及其檢測方法。該檢測方法是根據(jù)genbank公布的hiv病毒序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)hiv rt-lamp-lfd反應(yīng)系統(tǒng)所需引物與探針;采用本發(fā)明人配制的rna提取試劑提取hiv病毒rna，使用本發(fā)明建立的rt-lamp反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，依據(jù)反應(yīng)體系加入的檢測探針，在反應(yīng)結(jié)束后利用核酸快速檢測試紙判定結(jié)果。同現(xiàn)在hiv病毒的常用檢測技術(shù)相比，本發(fā)明有助于實(shí)現(xiàn)早期診斷，避免漏檢，有助于提高檢測的靈敏性、縮短檢測時(shí)間，是hiv診斷方法持續(xù)發(fā)展的主要方向。1.一種

2、hiv病毒rt-lamp-lfd檢測方法，其特征在于包括如下步驟:（hiv病毒）rna的提取:(1)取20-35mg含有hiv病毒的血液組織，加入300-500u l裂解液勻漿，離心;(2)取步驟(1)離心所得上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結(jié)合;(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗滌玻璃纖維素膜;(4)用rnase free water洗脫玻璃纖維素膜上吸附的rna;(5)配制預(yù)反應(yīng)液，所述預(yù)反應(yīng)液體積為15-20 u l，包括:1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2

3、mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的tris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜堿，1.5-1.8mmol/i. dntp, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段 引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列

4、見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :5(6)在16-25 u l預(yù)反應(yīng)液中加入4-10 u l步驟（4）所得rna作為模板，控制反應(yīng)體系總體積為20-25u l然后在溫度為60-65c，反應(yīng)15-65min；lfd試紙檢測:(7)取步驟(6)所得lamp擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物6-10 u l滴到lfd試紙的點(diǎn)樣處，然后在點(diǎn)樣處前端滴上60-100 ul緩沖液，5-20分鐘后根據(jù)試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(hiv rt-lamp-lfd檢測方法)，其特征在于:所述裂解液包括濃度為30-60mmol/l的ph7.3-7. 6 的t

5、ris-hcl，濃度為3-6mol/l的異硫氰酸胍，以及濃度為5-10mmol /l.edta.3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(hiv rt-lamp-lfd檢測方法)，其特征在于:所述去蛋白液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7. 6 tri s-hcl，濃度為0. 4-0. 6mol /l異硫氰酸胍，以及體積濃度為15-30%的無水乙醇。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(hiv rt-lamp-lfd檢測方法)，其特征在于:所述漂洗液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7.6 tris-hcl,55-150mmol/lnacl，以及體積濃度75%的無水乙醇。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或

6、3或4所述的(hiv rt-lamp-lfd檢測方法)，其特征在于:引物hiv-fip為5端生物素標(biāo)記引物;探針miv-fitc-probe為5端fitc標(biāo)記探針:6. 一種hiv病毒rt-lamp-lfd檢測試劑盒，其特征在于：包括rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液，16-20u l的rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液包括: 1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe精品.,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的t

7、ris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜堿，1.5-1.8mmol/i. dntp, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段，其余為rnase firee water.引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :57.根據(jù)權(quán)利要

8、求6所述的hiv rt-lamp-lfd檢測試劑盒，其特征在于: 引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :58.根據(jù)權(quán)利要求6所述的hiv rt-lamp-lfd檢測試劑盒，其特征在于:hiv病毒lamp-lfd檢測試劑盒還配有l(wèi)fd試紙用的緩沖液、陽性對照樣品和陰性對照樣品，其中l(wèi)fd試紙用的緩沖液為1xtae緩沖液，陽性對照樣品為hiv基因組病毒rna，陰性對照樣品為無核酸的rna

9、se firee waterhiv病毒rt-lamp-lfd檢測方法及其檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域000l 本發(fā)明涉及哺乳動物病毒檢測領(lǐng)域，特別涉及一種人體hiv病毒rt-lamp-lfd檢測方法及其檢測試劑盒。背景技術(shù)0002 hiv即人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，hiv），顧名思義它會造成人類免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒（lentivirus），屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失去抵抗力，從而導(dǎo)致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)

10、展到最后，導(dǎo)致艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合征） 0003研究表明，人類免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜，來自宿主細(xì)胞，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價(jià)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)（matrix），以及蛋白p24形成的半錐形衣殼（capsid），衣殼在電鏡下呈高電子密度。衣殼內(nèi)含有病毒的rna基因組、酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶）以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。其序列已測定并在genbank上登錄(登錄號分別為ay222839, ay222840)。目前該病毒的檢測方法有電鏡法、rt-pcr檢

11、測法、tas-fltsa檢測法等，但在實(shí)際檢測工作中，現(xiàn)有的檢測技術(shù)存在以下問題:一是靈敏度小，無法檢測到潛伏感毒樣品;二是容易產(chǎn)生假陽性，對模板質(zhì)量要求高;三是操作繁瑣，對實(shí)驗(yàn)條件要求高。0004 rt-lamp是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)，即依據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的原理，針對靶基因的特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用一種具有鏈置換特性的dna聚合酶和amv逆轉(zhuǎn)錄酶的同時(shí)作用下，使rt和lamp反應(yīng)在同管中同時(shí)進(jìn)行，簡化了操作步驟，在等溫條件下就可以高效、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。lamp產(chǎn)物的檢測一般采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察、熒光染料觀察等方法。0005側(cè)向流層析試紙(lateral

12、flow dipstick, lfd)是一種檢測產(chǎn)物的新方法，利用反應(yīng)體系中的fitc標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的lamp擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，減少了電泳環(huán)節(jié)、染料顏色的人為目測差異以及由非特異性擴(kuò)增造成的假陽性問題.lfd檢測相對于其他檢測手段，有操作簡便且安精品.全的特點(diǎn)。lamp-lfd反應(yīng)結(jié)果可以直接肉眼觀察。lfd試紙上有質(zhì)控帶和檢測帶，兩條帶都顯色表示陽性，只有質(zhì)控帶而檢測帶未顯色表明檢測結(jié)果為陰性。該方法具有安個、快捷、高效、高靈敏度且無高的實(shí)驗(yàn)條件要求，適合應(yīng)用推廣。目前，該技術(shù)在艾滋病病毒(hiv)的檢測中未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容0006本發(fā)明的目的在于是提供一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)

13、合色譜側(cè)向?qū)游鲈嚰垇頇z測艾滋病病毒(hiv)的方法，特異性強(qiáng)，敏感率高。0007本發(fā)明另一目的在于提供一種用于上述方法的檢測試劑盒，該試劑盒特異性強(qiáng)，敏感率高，而且操作簡便快捷，克服現(xiàn)有檢測方法不能在檢查中直接應(yīng)用的問題，適合艾滋病病毒(hiv)的篩查與預(yù)防。0008本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種艾滋病病毒(hiv)rt-lamp-lfd檢測方法，包括如下步驟:病毒rna的提取:(1)取20-35mg含有hiv病毒的血液組織，加入300-500裂解液勻漿，離心;(2)取步驟(1)離心所得上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結(jié)合;(3)依次用去蛋白液和

14、漂洗液洗滌玻璃纖維素膜;(4)用rnase free water洗脫玻璃纖維素膜上吸附的rna;所述預(yù)反應(yīng)液體積為15-20 u l，包括:1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的tris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜

15、堿，1.5-1.8mmol/i. dntp, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段 引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :5(6)在16-25 u l預(yù)反應(yīng)液中加入4-10 u l步驟（4）所得rna作為模板，控制反應(yīng)體系總體積為20-25u l然后在溫度為60-65c，反應(yīng)15-65min；lfd試紙檢測:(7)取步驟(6)所得lamp擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物6-10

16、 u l滴到lfd試紙的點(diǎn)樣處，然后在點(diǎn)樣處前端滴上60-100 ul緩沖液，5-20分鐘后根據(jù)試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。0009本發(fā)明的檢測方法是根據(jù)genhank公布的艾滋病病毒(hiv)序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了hiv病毒rt-lamp-lfd反應(yīng)系統(tǒng)所需引物與探針;病毒rna提取病毒rna，使用本發(fā)明建立的rt-lamp-lfd反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，依據(jù)反應(yīng)體系中加入的檢測探針，在反應(yīng)結(jié)束后利用核酸快速檢測試紙判定結(jié)果，結(jié)果顯示在61 30min, hiv病毒rna獲得了高效特異性擴(kuò)增。同現(xiàn)在hiv病毒的常用檢測技術(shù)相比，本發(fā)明有助于實(shí)現(xiàn)早期診斷，避免漏檢，有助于提高檢測的靈敏性、縮短檢測時(shí)

17、間，是hiv診斷方法持續(xù)發(fā)展的主要方向。0010作為優(yōu)選，所述裂解液包括濃度為30-60mmol/l的ph7.3-7. 6 的tris-hcl，濃度為3-6mol/l的異硫氰酸胍，以及濃度為5-10mmol /l.edta.0011作為優(yōu)選，所述去蛋白液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7. 6 tri s-hcl，濃度為0. 4-0. 6mol /l異硫氰酸胍，以及體積濃度為15-30%的無水乙醇。0012作為優(yōu)選，所述漂洗液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7.6 tris-hcl,55-150mmol/lnacl，以及體積濃度75%的無水乙醇。0013作為優(yōu)選，引

18、物hiv-fip為5端生物素標(biāo)記引物;探針hiv-ftic-probe為5精品.端ftic標(biāo)記探針。0014一種hiv病毒rt-lamp-lfd檢測試劑盒，其特征在于：包括rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液，16-20u l的rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液包括: 1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的tris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/

19、1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜堿，1.5-1.8mmol/i. dntp, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段，其余為rnase firee watero引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :50015作為優(yōu)選，引物hiv-fip為5端生物素標(biāo)記引物;探針hiv-ftic-p

20、robe為5端ftic標(biāo)記探針。0016作為優(yōu)選，hiv病毒rt-lamp-lfd檢測試劑盒還配有l(wèi)fd試紙用的緩沖液、陽性對照樣品和陰性對照樣品，其中l(wèi)fd試紙用的緩沖液為1 x tae緩沖液，陽性對照樣品為hiv病毒基因組rna，陰性對照樣品為無核酸的rnase firee water0017本發(fā)明的有益效果是: 1、本發(fā)明所采用引物組是根據(jù)hiv衣殼蛋白基因的六個不同區(qū)域設(shè)計(jì)的，又有rna的特異性探針相結(jié)合，特異性比常規(guī)pcr強(qiáng)。0018 2、本發(fā)明的檢測試劑盒檢測靈敏度高，是常規(guī)pcr的102-103倍。0019 3、本發(fā)明的檢測試劑盒檢測時(shí)間短，可以在30-60min內(nèi)獲得檢測結(jié)果，

21、比常規(guī)pcr節(jié)約3.5-4.5小時(shí)。0020 4、本發(fā)明的檢測試劑盒對儀器設(shè)備要求低，不需要普通pcr所用的pcr儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)。0021 5、本發(fā)明中的病毒rna提取方法簡單快捷，而且不用到氯仿、巰基乙醇等有害物質(zhì)。0022 6、本發(fā)明的檢測試劑盒操作步驟簡單，結(jié)果直觀易判定。0023 7、本發(fā)明的檢測試劑盒對人和環(huán)境較安，整個過程不使用有毒物質(zhì)。0024 附圖說明0025 圖1為擴(kuò)增溫度對rt-lamp反應(yīng)的影響圖。m:100bp dna ladder marker(takara公司);泳道1:61恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果;泳道2 :63溫度條件下擴(kuò)增結(jié)果;泳道3:65溫度條件下擴(kuò)增結(jié)果

22、。0026 圖2為mrnv rt-lamp特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。m:l00bp dna ladder marker(takara公.d);泳道1:羅氏沼蝦野田村病毒;泳道2:南美白對蝦白斑綜合癥病毒（wssv);泳道3:草魚呼腸孤病毒（gorv;泳道4:對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(ihhnv;泳道5:對蝦桃拉病毒(tsv);泳道6:陰性對照。0027 圖3為本發(fā)明的檢測方法檢測感染mrnv樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。m :100bp dna laddermarker(takara公司);左側(cè)泳道1：mrnv樣品rt-lamp反應(yīng):30min。檢測結(jié)果;左側(cè)泳道2:mrnv樣品rt-lamp反應(yīng)45min檢

23、測結(jié)果;nt:為陰性對照樣品檢測結(jié)果:右側(cè)為lfd試紙檢測顯色結(jié)果。0028 圖4為本發(fā)明的檢測方法檢測mrnv的靈敏度比較圖和lfd試紙顯色對比圖。m：100bp dna ladder marker(takara公司);左側(cè)泳道1-6:模板分別為10-1,10-2,10-3,10-4,105,106倍稀釋的基因組rna;泳道7:無模板;右側(cè)1-7:為左側(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的lfd試紙檢測圖。精品.具體實(shí)施方式0029 下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。0030 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，

24、均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。0031本發(fā)明實(shí)施如下: 一種艾滋病病毒hiv-rt-lamp-lfd檢測方法，包括如下步驟:病毒rna的提取: (1) 取20-35mg含有hiv病毒的血液組織，加入300-500u l裂解液勻漿，離心;(12000rpm離心1-2min)0032 所述裂解液包括濃度為30-60mmol/l的ph7.3-7. 6 的tris-hcl，濃度為3-6mol/l的異硫氰酸胍，以及濃度為5-10mmol /l.edta.其余為rnase free water。0033 (2)取步驟(1)離心所得上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結(jié)合;將混合液與玻

25、璃纖維素膜結(jié)合具體操作為:將混合液轉(zhuǎn)入帶有玻璃纖維素膜的吸附柱中，12000rpm離心1-2min,棄掉廢液，這樣混合液與玻璃纖維素膜就結(jié)合。0034 （3)依次用去蛋白液和漂洗液洗滌玻璃纖維素膜。0035 去蛋白液洗滌玻璃纖維素膜具體操作為:向吸附柱中加入400-600 u l去蛋白液，室溫靜1-2min,12000rpm離心30-60s，棄掉廢液。0036 所述去蛋白液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7. 6 tri s-hcl，濃度為0. 4-0. 6mol /l異硫氰酸胍，以及體積濃度為15-30%的無水乙醇。0037 漂洗液洗滌玻璃纖維素膜具體操作為:向吸附柱中加入40

26、0-600 u l漂洗液，12000rpm離心30-60s，棄掉廢液，重復(fù)該步驟一次。0038 所述漂洗液包括濃度為10-50mmol/l的ph7.3-7.6 tris-hcl,55-150mmol/lnacl，以及體積濃度75%的無水乙醇。0039 (4)用rnase free water洗脫玻璃纖維素膜上吸附的rna，具體操作為:在吸附柱中加入30-50u l rnase free water(市售)，室溫放置1-2min,12000rpm離心1-2min重復(fù)該步驟一次，增加rna洗脫量。0040 rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng): (5)配制預(yù)反應(yīng)液，所述預(yù)反應(yīng)液體積為15-20 u l，包括:

27、1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的tris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜堿，1.5-1.8mmol/i. dntp, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段 0041 引物hiv-fip序

28、列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :50042 hiv-rt-lamp引物、探針設(shè)計(jì)與篩選 本發(fā)明所述的引物是根據(jù)genbank公布的rna2序列，由在線軟件primerexplorerv4 (http: primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)和手工修改后獲得，利用不同引物的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行篩選，由其中選出兩對引物和一條探針。0043引物hiv-f3（seq id n0:3):gatacaacaa

29、ctattccattgattg0044引物hiv-b3（seq id n0:4)tgtaggattaatttgtggcatg0045引物hiv-fip（seq id no :1): gcaagaggtaaaatacaccctgtt-tactatactggtcaagataaagaga精品.0046引物hiv-bip（seq id no :2): agtggtgaagccattacaaatga-gaaaatccacagacccaatc0047探針hiv-fitc-probe (seq id n0 :5): ctcttgcaagtgactacactacttaa0048其中hiv-fip為5端生物素(

30、biotin)標(biāo)記引物;hiv-fitc-probe為5端fitc標(biāo)記探針。0049 (6) 在16-25 u l預(yù)反應(yīng)液中加入4-10 u l步驟（4）所得rna作為模板，控制反應(yīng)體系總體積為20-25u l然后在溫度為60-65c，反應(yīng)15-65min；0050 lfd試紙檢測: (7)取步驟(6)所得lamp擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物6-10 u l滴到lfd試紙的點(diǎn)樣處，然后在點(diǎn)樣處前端滴上60-100 ul緩沖液，5-20分鐘后根據(jù)試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。當(dāng)僅出現(xiàn)質(zhì)控帶時(shí)表明反應(yīng)結(jié)果為陰性，當(dāng)質(zhì)控帶和檢測帶同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，表明反應(yīng)結(jié)果為陽性。0051 一種hiv病毒rt-lamp-lfd檢測試劑

31、盒，其特征在于：包括rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液，16-20u l的rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液包括: 1.5-2.0mmol /l引物hiv-fip,1.5-2.0mmol/l引物hiv-bip,0.2mmol/i引物hiv-f3,0.2mmol/1引物hiv-b3,0.05-0.20umol /l探針hiv-fitc-probe,15-30mmol/l. ph8.5-9.5的tris-hcl，10-25mmol/i氯化鉀，10-25 mmol/1硫酸銨，5-l5mmol/i硫酸鎂，0.15-0.35%triton x-100,0.4-0.9mo1/i甜菜堿，1.5-1.8mmol/i. dnt

32、p, 1-3u逆轉(zhuǎn)錄酶amv, 5-15u bstdna聚合酶大片段，其余為rnase firee water.0052 引物hiv-fip序列見seq id n0 :1，引物hiv-bip序列見seq id n0 :2，引物hiv-f3序列見seq id n0:3，引物hiv-b3序列見seq id no:4，探針hiv-fitc-probe序列見seq id n0 :50053 rt- lamp擴(kuò)增反應(yīng)液裝于rt-lamp核酸反應(yīng)管中，rt-lamp核酸反應(yīng)管中添加有穩(wěn)定液，穩(wěn)定液為液體石蠟油。穩(wěn)定液滴加在rt-lamp核酸反應(yīng)管中，用于液封，穩(wěn)定液用量在5-10 u l 。0054 檢測

33、試劑盒還配有l(wèi)fd試紙用的緩沖液、陽性對照樣品和陰性對照樣品，其中l(wèi)fd試紙用的緩沖液為1x tae緩沖液，陽性對照樣品為hiv病毒基因組rna,陰性對照樣品為無核酸的rnase free water0055本發(fā)明的上述方案在其范圍內(nèi)都是可以實(shí)施的，以下以一個典型實(shí)施方案來具體說明本發(fā)明的具體操作步驟。0056典型實(shí)施方案: 1、材料 被感染的人體hiv病毒細(xì)胞采集自寧波第一醫(yī)院;所用引物與探針由上海生工生物公司合成;bst dna聚合酶大片段購自new england bipolabs公司:;逆轉(zhuǎn)錄酶amv, dntp購自takara公司;甜菜堿、硫酸鎂等購自sigma公司。0057 2、羅氏沼蝦樣品病毒rna的提取: (1）取20mg被感染的人體hiv病毒細(xì)胞組織，加入500 u l裂解液后用一次性研磨棒研磨，等徹底勻漿后,12000rpm離心2min，吸取上清液至新的離心管; (2）向裝有上清液的新的離心管中加入等體積(與上清液等體積)的70%無水乙醇后，混合均勻; （3）將混合液體轉(zhuǎn)入帶有玻璃纖維素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm離心l min，棄掉廢液;精品. （4）向吸附柱中加入550 u l去蛋白液，室溫靜置1min,12000rpm離心30s，棄掉廢液; （5）加入600 u l漂洗液,12000rpm離心30s，棄掉廢液;重