熒光膜片鉗新技術(shù)的應(yīng)用精品資料

1、BEA 光 熒W的mnnn生.物.化.學(xué).與.生.物.物.理.進(jìn).展.雜.志.年.第.二期UUUUUUUUUUnU摘一要.nnnn口熒一光一膜.片-鉗一- cc ALJlet亠是將一離一丄通.道蛋白局K 立口的構(gòu)象變化-和一門控緊密結(jié)合亠實(shí)時-記-錄一同一膜片-上-離子-通道的熒光-和-電流信號的創(chuàng)一新一型一生一物一物一理一學(xué)一技一術(shù)一，一其特一點(diǎn)一是一將一經(jīng)一典一的一膜一片鉗一和現(xiàn)代光學(xué)記錄結(jié)一合起來，-實(shí)時同步完美呈-現(xiàn)一旦丄通一道一執(zhí)-行_其一功一能一時_的一蛋一白一質(zhì)-構(gòu)一象一信一息一亠與一研一究一結(jié)一構(gòu)一的x射一線一和一冰一凍一電一鏡一不一同一，一熒一光膜片鉗提供一離子通道處于真實(shí)一

2、細(xì)胞膜生一理環(huán)境-并一執(zhí)-行-功一能一的一實(shí)時一動一態(tài)一結(jié)一構(gòu)一信一息一隨一著一新一的一光一學(xué)一技一術(shù)一顯一微一成一像一技一術(shù)一圖一像一分一析一技一術(shù)一等一的一進(jìn)一步一，-大一大一地一擴(kuò)-展-丄熒一光一膜-片一鉗-技一術(shù)一的一記一錄一范一圍-分一辨-精-度-及一敏一感一度-亠使研一究者-以前-所一未有一的時一空分辨率來實(shí)時觀一察和記錄離子通道蛋白的-結(jié)一構(gòu)-變一化一關(guān)一鍵-詞一IIIIIIIIII熒光膜片鉗,熒光分子,蛋白質(zhì)構(gòu)象,膜蛋白，一門控n匚nnnn離.丄通.道.和.轉(zhuǎn).運(yùn).蛋.白.是.一類.復(fù)一雜.的.細(xì).胞.膜.蛋.白，-其存在使得細(xì)胞-細(xì)胞間以-及細(xì)胞-環(huán)境間一離.丄交.換.及.相

3、.關(guān)-的一信.息一交-流一成.為.可-能.，-其.功.匕匕 厶冃的一執(zhí).行-同一蛋.白一質(zhì)結(jié)一構(gòu).變一化-息一息.相一關(guān)離一丄通.道的開一放和一關(guān)閉的過程稱為n控，一離丄通道n控的一過-程是以-蛋白質(zhì)構(gòu).象二g一三的一形式實(shí)現(xiàn)的，-精一確一地一觀一察一解一析一構(gòu)一象一變一化一及其一在一信一號轉(zhuǎn)一導(dǎo)一中一的一作用是揭示通道蛋白功能的分子機(jī)制的關(guān)n鍵一亠長一期一以一來一，一對_離一丄通一道一門_控一的一研_究一通一常一采一用一膜一片一鉗一這一個金一標(biāo)一準(zhǔn)一技一術(shù)一來一實(shí)一現(xiàn)一亠隨一著一對一離子一通道研究一的深入，一簡單地記一錄離丄電一流顯示一出一丄它一的一局一限一-首一先一，一旦丄電-流一反一映一

4、的一是-通一道-在一開一放一狀一態(tài)一下的一功一能一指一標(biāo)一亠它一無一法一直一接一反一映一通一道-蛋一白一在一門控一的一過一程一中一結(jié)一構(gòu)一變一化一的一特一性一丄其-次一由一丄離一丄電一流僅一存在一丄開一放狀態(tài)亠在多-重-關(guān)閉一狀態(tài)旦及一過渡狀態(tài)一的信息是缺失的亠熒光膜-片-鉗-1亟ur，-PPF)1是-用一來一研一究一這一些一缺一失一的一信-息-的一厶種一新-的一實(shí)一驗(yàn)一技一術(shù)一亠熒一光一膜-片-鉗借助特異位點(diǎn)熒光記錄使在細(xì)胞膜環(huán)境下直接實(shí)一時觀一察蛋白一質(zhì)分丄活一動成一為一可匕匕 厶冃，一實(shí)一現(xiàn)一同一時記.錄.細(xì).胞.膜.片.丄的.離.子.通.道.蛋.白.的-局.部一結(jié).構(gòu).變化-和-功匕匕

5、 厶冃狀-態(tài)為了-獲取各種-與功匕匕 厶冃相對-應(yīng)的一結(jié).構(gòu).構(gòu).象一信.息一，-熒一光.膜.片-鉗一利.用.熒.光.分.丄作-為一定.位一探針.，-熒光-團(tuán).被一嵌一到一通一道一蛋一白一或.通.道配體一分丄的特異位點(diǎn)(-圖，一研究者可一同時-記-錄一特異位點(diǎn)一的實(shí)時-熒.光-和一電流一熒一光-膜片鉗一技一術(shù)的一應(yīng)一用一為膜一蛋一白一及相一關(guān)一轉(zhuǎn)一運(yùn)一蛋一白一膜一受體一蛋白結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系研究提供了丄全新的-工具一亠丄熒一光一電一壓一鉗一技一術(shù)在過一去的幾丄年里，一電一生理技術(shù)一的應(yīng)用一使一離子通一道一的一功一能一和一調(diào)一控一被一廣一泛一研一究一，一通一道一蛋一白一的一詳一細(xì)一結(jié)一構(gòu)一信一息一則

6、一采一用一x射一線一和一冰一凍一電一鏡一的一方一法一獲一得一，-特一別一是-冰一凍一電一鏡-技一術(shù)一的一使一用一亠在一近一兩一年一提-供一丄大一量-存在一丄膜一環(huán)一境一中一的通一道-蛋-白的結(jié)構(gòu)信一息然而一，-這一些方法要么一單純跟蹤功匕匕 厶冃變化，-要-么一只-顯-示-蛋-白-質(zhì)-結(jié)一構(gòu)一，-沒_有-種一方_法一可一以一直-接-將-離-丄通-道-的一構(gòu)一象-變一化一和功一能-狀一態(tài)一結(jié)一合一起一I來為了克服這一缺陷,不同的光譜技術(shù)被嘗試著與一經(jīng)典的電生m 二 理學(xué)方一法結(jié)合一，一將同一時檢一測一通.道.功.能.和.構(gòu).象一變.化.直.接.聯(lián).系一起.*20一世-紀(jì).9年代-，-JS等建立-

7、丄熒光電壓-鉗nUnU 0，-v(技.術(shù)一，-研.究-鉀離.丄通.道一蛋一白.的一電一壓-敏一感.域一在-電-壓一激一活.過一程一丄的-運(yùn).I動亠最初熒光一電壓鉗用-來一記錄爪一蟾卵母細(xì)一胞全細(xì)胞一模式-丄的-功一匕匕 厶冃性離丄通道-在一實(shí)驗(yàn)前幾-n天，一編一碼一包一含一半一胱氨一酸一離一子通一道一蛋一白一的一m通一過顯微注射，-表達(dá)于非-洲一爪-蟾卵一母細(xì)胞一，-隨后將一卵-母一細(xì)一胞一浸一入一包一含-可_與一半_胱一氨一酸一反_應(yīng)一的_熒一光一團(tuán)一的一溶一液一中一，一在一卵一母一細(xì)一胞一胞一外一暴一露一的一丄胱一氨一酸一殘基即可與熒一光一團(tuán)分子通過形成一共一價鍵被一熒光標(biāo)-定一亠通一常-

8、選一取一卵-母一細(xì)一胞一富一含一色-素一丄胞一體一組一分-中一產(chǎn)一生一的一自一發(fā)一熒一光一較一少的一動一物一極一進(jìn)一行一熒一光一記一錄實(shí)驗(yàn)中電一壓一鉗記錄一電一壓一敏感離子通道的激活一及一檢測一通一道-的一功能一狀態(tài)亠熒光變化直-接一記錄暴露于一細(xì)胞外一側(cè)一的一蛋白一質(zhì)一結(jié)構(gòu)的一實(shí)一時運(yùn)一動一，-其開-發(fā)-者-將-這一厶技一術(shù)_命-名-為-熒一光一電-壓一鉗-7亠隨-著-該-項(xiàng)一技一術(shù)一的發(fā)一展-亠結(jié)一合-熒一光電一壓一鉗-和-熒一光一共一振能量轉(zhuǎn)移cene n erFaer,技術(shù)研究人員證明了電壓敏感鉀通道的第四跨膜域在電壓門控通道的激活過程中經(jīng)歷了原子水平分辨率的轉(zhuǎn)動和可匕匕 厶冃的平移運(yùn)

9、動7-9同時熒光電壓鉗也被應(yīng)用到不同家族的離子通道及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體蛋白的研究10-17然而研究者發(fā)現(xiàn)熒光電壓鉗受其/、電壓鉗制模式和敏感性的限制無法解決對于離子通道胞內(nèi)部分的結(jié)構(gòu)變化問題-2熒光膜片鉗技術(shù)2-1熒光膜片鉗技術(shù)及其/、應(yīng)用2000年受熒光電壓鉗的啟發(fā)Zheng與Zagotta1共同努力一一一種新的結(jié)合熒光記錄和內(nèi)面向外膜片鉗模式的熒光膜片鉗(PC:F)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生該技術(shù)最初設(shè)計解決環(huán)核苷酸門控(CNG)通道蛋白與cG；MP結(jié)合所產(chǎn)生的化學(xué)能-如何驅(qū)動通道被激活的問題首次報道的熒光膜片鉗研究中將馬來酰亞胺用Alejxa488熒光標(biāo)記后觀察其/、修飾CN(G通道蛋白上的半胱氨酸(胞

10、內(nèi)C端環(huán)核苷酸結(jié)合域的C4位占八、)的作用通過記錄熒光信號判斷修飾所引發(fā)的通道蛋白結(jié)構(gòu)變化從而影響cGMP與CN(扌通道蛋白結(jié)合以及通道的激活實(shí)驗(yàn)時采用一一一根開口大約為幾微米的拋光玻璃電極封接表達(dá)于包含半胱氨酸的離子通道蛋白的細(xì)胞膜表面通過拉回玻璃電極使細(xì)胞表面撕下的一一一小塊細(xì)胞膜附著于玻璃電極尖部熒光團(tuán)標(biāo)記和記錄都在這一一一平方微米尺度的細(xì)胞膜片上進(jìn)行熒光膜片鉗允許在通道蛋白的胞內(nèi)及胞外兩側(cè)記錄熒光信號由于熒光信號記錄的是從一一一小片游離膜上包含的離子通道信息由胞內(nèi)組分所產(chǎn)生的自發(fā)熒光造成的污染被除去-這使得熒光信號的信噪比增加從而得到更高的分辨率當(dāng)結(jié)合高度敏感性、低噪聲的熒光探測器熒光

11、膜片鉗可以記錄到單獨(dú)一一一個蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時記錄-基于內(nèi)面向外的熒光膜片鉗被稱為經(jīng)典熒光膜片鉗而后不同的研究小組也陸續(xù)報道了全細(xì)胞模式、細(xì)胞貼附模式的熒光膜片鉗作為熒光膜片鉗技術(shù)的擴(kuò)展Yang等將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用到HEK（全細(xì)胞模式下溫度敏感TRF，離子通道的溫度激活的實(shí)驗(yàn)研究中采用全細(xì)胞模式同時記錄通道電流和熒光信號使得熒光膜片鉗最初的大部分優(yōu)勢得以保留在電流發(fā)生階段全細(xì)胞熒光膜片鉗只記錄胞外標(biāo)疋的熒光團(tuán)-到目刖為止熒光膜片鉗被應(yīng)用于CN(G通道門控及構(gòu)象變化關(guān)系1,18、CNG孑通道蛋白亞基配比19、HCNd通道在超極化激活下配體結(jié)合和門控間的關(guān)系研究20-23M()ny等2-4

12、應(yīng)用熒光膜片鉗結(jié)合熒光電壓鉗對質(zhì)子通道Hv1的門控研究揭示了通道激活過程中S1和S4的結(jié)構(gòu)重排指出兩部分在通道活動中既相互獨(dú)立又相互影響的特性-最近Nomnura等5將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌源的機(jī)械刺激敏感通道在人工構(gòu)建的脂質(zhì)膜中重組的方向特性研究-毫無疑問膜片鉗的多種鉗制模式使開發(fā)熒-光1膜片鉗新方法具/、有了許多優(yōu)勢22熒光膜片鉗技術(shù)優(yōu)勢熒光膜片鉗技術(shù)對胞膜上離子通道的特異位占采用熒光標(biāo)記研究者可以直接觀察發(fā)生在特疋通道結(jié)構(gòu)上的實(shí)時構(gòu)象重排半胱氨酸通過基因突變技術(shù)被引入到通道蛋白的興趣位占八、如果必要通道蛋白丄原有的一丄胱一氨酸可旦通過基因一突變一被一全一K 立口替一換.以.確.保.所.

13、有.記錄.信.號.的-特.異.性.丄胱-氨.酸.殘基作-為與基特異反-應(yīng).的熒光-團(tuán)的定位點(diǎn)，-允一許-特.異.位.點(diǎn)-熒.光-團(tuán)一標(biāo)-定.-電一流-和熒.光.信.號.被.同一時一從.同一一組.離一子通一道.蛋一白一記一錄.，-這一是一熒-光.膜.片鉗一與熒光電壓鉗的主-要區(qū)別之一電流一信號，-作-為通道丄放和-離丄流動的-結(jié)一果，-可-做為通一道一功一匕匕 厶冃的一指一示一器一亠當(dāng)丄胱一氨一酸一附一近的一蛋一白一質(zhì)一結(jié)構(gòu)重排影響-到熒光團(tuán)一的一量子產(chǎn)出一遷一移率與-鄰一近一的一熒一光_團(tuán)-的_距一離一變一化_等一旦素一時_，一熒一光一發(fā)一射一也一發(fā)一生一改一變一亠這一竺，一熒一光一團(tuán)一可一作

14、一為一蛋一白一質(zhì)一構(gòu)一象變一化一的高度敏感的報一告基團(tuán)亠因一為熒一光一信號不一像一離一子一電一流一信一號-那一樣一依一賴一丄離一丄通一道一孔一區(qū)一的一開一放一，-熒一光一記一錄一為一探一究一離一丄通一道-蛋一白一到一達(dá)一開一放一狀態(tài)一前的構(gòu)象變化一的時一空信息提供一丄個新的手一段一亠熒光膜一片一鉗-作一為種全一新-的研究正常-功能下一通道蛋白一分子一活動一的一方一法，-可一以廣一泛一應(yīng)用丄任_何-通-道-類一型-，-甚-至-可-旦嘗-試一非一通-道-的一膜-蛋-白一，-如-轉(zhuǎn)-運(yùn)一蛋-白一受-體蛋-白等-亠研一究也一表-明一亠熒光記錄也可以成為高通量藥物篩選中電流記錄的有效替代26-與直徑1m

15、mn的卵母細(xì)胞相比分離的膜片要小得多-那么為什么還能.得到足夠強(qiáng)的熒光信號呢?這其/、中的原因主要有兩個-第一一一在HEK細(xì)胞膜上可以高密度地表達(dá)通道蛋白對許多離子通道而-_:言從一一一片分離的細(xì)胞膜上可以得到幾百到幾千個通道分子因?yàn)槊舾械墓鈱W(xué)探測器(如CCD）相機(jī))可以觀察單個熒光分子成百上千個熒光分子所發(fā)出的熒光在檢測上自然沒有問題第二二二因?yàn)槟て苄∵@樣就可以使用高采光效率的光學(xué)鏡頭(如40倍數(shù)值孔徑NA值大于1.4的高分辨物鏡)采集整個膜片上所有的熒光信號與之相比卵母細(xì)胞雖然很大但大多數(shù)熒光都沒有被收集到熒光膜片鉗記錄提供了優(yōu)越的敏感性和時間分辨率而且同熒光電壓鉗記錄相比(圖2)熒光膜片鉗可以直接控制胞內(nèi)環(huán)境優(yōu)勢如下:第一一一可以面對離子通道胞內(nèi)一一一側(cè)并對相關(guān)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)疋第二二二排除了由胞內(nèi)環(huán)境所造成的自發(fā)熒光熒光探測敏感性大為提高7第-三可以施加胞內(nèi)配體及通道調(diào)節(jié)分子來調(diào)一節(jié)一通道的1、-控第一四電流一記錄具一有一更高的時間分辨率,2n熒.光膜片鉗.利用丄熒光分子-作-為定位分.子-探針-，-這些熒光-