核移植技術與動物克隆[稻谷書苑]

1、第六章第六章 核移植技術與動物克隆核移植技術與動物克隆 山東師范大學生命科學學院 1教育教學 一、什么是動物克??？一、什么是動物克??？ 動物克隆是一種通過核移植過程進行無性繁殖的 技術。發(fā)育早期的動物胚胎細胞，或成年動物的體 細胞，經(jīng)顯微手術移植到去掉細胞核的卵母細胞中 之后，在適當?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚 胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中， 可以發(fā)育成為正常動物個體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的 動物，其遺傳結構與細胞核供體完全相同。動物，其遺傳結構與細胞核供體完全相同。這種不這種不 經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結構經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳

2、結構 與細胞核供體相同動物個體的技術，就叫做動物克與細胞核供體相同動物個體的技術，就叫做動物克 隆。隆。 2教育教學 核移植技術：核移植技術：所謂核移植技術就是利用顯微操作技所謂核移植技術就是利用顯微操作技 術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或者將兩 個細胞的細胞核（或細胞質）進行交換，從而可能創(chuàng)造個細胞的細胞核（或細胞質）進行交換，從而可能創(chuàng)造 無性雜交生物新品種的一項技術。無性雜交生物新品種的一項技術。 3教育教學 胚胚 胎胎 克克 ?。郝。菏褂玫暮斯w細胞如果來自多細胞階段使用的核供體細胞如果來自多細胞階段 的胚胎，叫做的胚胎，叫做胚

3、胎克隆胚胎克隆。 體細胞克隆：體細胞克?。菏褂玫暮斯w細胞來自動物體，叫做使用的核供體細胞來自動物體，叫做 體細胞克隆體細胞克隆。 4教育教學 5教育教學 6教育教學 7教育教學 8教育教學 二、兩棲類細胞核移植 1938年Spemann最先提出將多細胞胚胎的每一個細胞核移植到 去掉核的卵母細胞中，使它們重新發(fā)育成胚胎的設想。 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和實驗技術，首次 獲得兩棲動物美洲豹蛙胚胎細胞核移植的后代 核供體為囊胚期的胚胎細胞實驗成功 核供體為原腸胚期的中胚層和內胚層細胞實驗失敗 9教育教學 n1958年到年到1962年，英國劍橋大學的年，英國劍橋大學

4、的John Gurdon和和Machineer利用爪利用爪 蟾原腸內胚層細胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾蟾原腸內胚層細胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾 n1970年年John Gurdon以同樣的方法，用青蛙腳蹼角質化細胞進行移核以同樣的方法，用青蛙腳蹼角質化細胞進行移核 試驗，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。試驗，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。 10教育教學 三、魚類的核移植 從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍 魚為材料，進行魚類不同亞科間的細胞核移 植獲得成功，用以研究雜交細胞核與純種細 胞核在發(fā)育功能上的差異，以及細胞質對細 胞核的影響 11教育教學 1979年，中國科學院武漢水生物研究所 利用鯽魚做移核試驗。

5、他們把鯽魚囊胚期細 胞經(jīng)過385天59代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，再將此 種培養(yǎng)細胞的細胞核移植到同種鯽魚的未受 精卵中。到1980年4月，他們成功地培育了 兩尾無性繁殖的幼魚，其中一條發(fā)育正常。 12教育教學 1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細 胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實現(xiàn)了不同 種間的核質雜交，成功地無性繁殖了“鯉鯽核 魚”新品種。 13教育教學 四、哺乳類的細胞核移植 1977年，美國緬因州巴爾港的杰克遜實 驗室用“亞無性繁殖”的方式，培育出7只 單親小鼠。 14教育教學 u將卵細胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后 放入加有適量細胞松馳B的溶液中。 u經(jīng)此番處理的卵細胞的染色

6、體復制后出現(xiàn)了兩個核，將此 雙核細胞放入正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 u卵中的雙核細胞自動融合，并且細胞開始分裂。 u將此種胚胎移入母鼠子宮培育。 u生產(chǎn)出7只單親小鼠。 15教育教學 1981年，瑞士日內瓦大學和美國杰克遜實驗室 合作，首次對小鼠卵進行移核試驗獲得成功。他們 將囊胚內細胞團細胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng) 培養(yǎng)移核卵發(fā)育至囊胚期，再將此胚胎移入同步孕 鼠子宮內，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可 育的個體。 16教育教學 17教育教學 五、核移植技術的一般操作程序五、核移植技術的一般操作程序 核移植克隆哺乳動物的技術操作過程主要 包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、 重組胚的體外或體

7、內培養(yǎng)、核移植胚胎移入 代孕母畜（寄母）等步驟 。 18教育教學 1 1核受體細胞的準備核受體細胞的準備 去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞。這是因為在 卵母細胞的細胞質含有某種特定的因子，可以使移植核中所含 有的基因表達程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了的細胞重新回 到發(fā)育過程的原點，同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。 卵母細胞的來源有兩種方式：一是用激素對雌體進行超 排處理，從輸卵管沖出體內成熟的M卵母細胞。二是從屠宰 場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，在 體外培養(yǎng)成熟后作為受體。 19教育教學 2核供體細胞的準備核供體細胞的準備 20教育教學 3 3細胞核移植細胞核移植

8、21教育教學 4激活激活 卵母細胞的激活涉及的因素很多，無論是受精引起的卵卵母細胞的激活涉及的因素很多，無論是受精引起的卵 母細胞激活還是人工的激活，都會引起卵母細胞發(fā)生一系列母細胞激活還是人工的激活，都會引起卵母細胞發(fā)生一系列 的反應，這些反應是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過的反應，這些反應是胚胎發(fā)育所必需的。其激活原理是通過 電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從MIIMII期中解放出來，期中解放出來， 并轉到并轉到“受精受精”的狀態(tài)。的狀態(tài)。 22教育教學 5重組胚的體內或體外培養(yǎng)重組胚的體內或體外培養(yǎng) 經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內或體

9、外培養(yǎng)，經(jīng)融合和激活的重組胚移入中間受體作體內或體外培養(yǎng)， 觀察重組胚的發(fā)育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內培養(yǎng)觀察重組胚的發(fā)育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內培養(yǎng) 方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入方法獲得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入 休情期的母羊結扎的輸卵管中體內培養(yǎng)休情期的母羊結扎的輸卵管中體內培養(yǎng)4-7d4-7d，發(fā)育至桑椹胚和，發(fā)育至桑椹胚和 囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內作體內囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內作體內 培養(yǎng)培養(yǎng)7d7d，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔

10、的核移植胚多作體外培 養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。 23教育教學 6 6胚胎移植胚胎移植 重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種 不同、繁殖性能強、體格稍大的當?shù)仄贩N，進行同期發(fā)情處理， 按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。 24教育教學 六、六、 核移植技術的應用核移植技術的應用 1制備轉基因克隆動物，制備轉基因克隆動物， 進行生物藥物生產(chǎn)；進行生物藥物生產(chǎn)； 2培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群 ； 3開展異種動物克隆，拯救瀕危動物；開展異種動物克隆，拯救瀕危動物； 4與干細胞技術結合，開展治療性克隆與干細胞技術結合，開

11、展治療性克隆 5利用核移植技術，研究生物學的基本問題利用核移植技術，研究生物學的基本問題 。 25教育教學 七、克隆羊與體細胞核移植 26教育教學 a.胚胎細胞株胚胎細胞株, b.胚胎纖維母細胞胚胎纖維母細胞 c.乳腺上皮細胞乳腺上皮細胞, d.PCR microsatellite 27教育教學 28教育教學 第一步第一步 取妊娠期的6歲母綿羊（Finn Dorset白品種母羊） 的乳腺細胞作核供體細胞，用饑餓法使其進入休眠 狀態(tài)而使全部基因具有活性。 29教育教學 第二步第二步 注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑 面母綿羊）排卵，2833小時取其未受精卵，快速去

12、核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，使其 進入G0期做受體細胞。 30教育教學 第三步第三步 乳腺細胞與無核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電 流的作用下，將乳腺細胞融入卵中，形成一個含有 新的遺傳物質的卵細胞。 31教育教學 第四步第四步 新的卵細胞植入羊的結扎的輸卵管內，新的卵細胞植入羊的結扎的輸卵管內，6 6天天 后發(fā)育為桑椹胚或囊胚（后發(fā)育為桑椹胚或囊胚（816816個細胞）。個細胞）。 32教育教學 第五步第五步 將此早期胚胎移入假孕母羊子宮中，產(chǎn)下多利 即為6歲母羊的復制品，也為白色。 33教育教學 34教育教學 35教育教學 為何是突破性的工作：為何是突破性的工作：

13、 第一，解決了使供 體細胞與核受體細 胞（去核卵細胞） 同步的方法。 第二，解決了用體 細胞做核供體與轉 基因的問題。 36教育教學 這一成果的重要生物學意義：這一成果的重要生物學意義： 第一，它證明了一個已經(jīng)完全分化了的動物體 細胞仍然保持著當初胚胎細胞的全部遺傳信息，并 且經(jīng)此技術處理后，體細胞恢復了失去的全能性形 成完整個體。 37教育教學 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳動物體 細胞作為供體細胞繁殖的克隆羊，即成體母羊的復 制品。它的成功提示我們可以進一步做到，在培育 體細胞成為核供體之前，利用“基因靶”技術精確 地誘發(fā)核基因的遺傳改變或精確地植入目的基因， 再用選擇技術準確地挑選那

14、些產(chǎn)生了令人滿意變化 的細胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就 是說，我們可以按照人的意志去改選、生產(chǎn)物種。 38教育教學 第三，在現(xiàn)代生物學領域中，沿有任何一項研 究成果能夠比通過對基因進行有規(guī)律地控制而解決 更多的問題的先例。多利羊的誕生及生長表明，利 用克隆技術復制哺乳類動物的最后技術障礙已被突 破，在理論上已成為可能。 39教育教學 八、克隆技術存在的問題 理論問題理論問題 分化的體細胞克隆對遺傳物質重編（細胞核內所有或大部分基因關閉，分化的體細胞克隆對遺傳物質重編（細胞核內所有或大部分基因關閉， 細胞重新恢復全能性的過程）的機理還不清楚；細胞重新恢復全能性的過程）的機理還不清楚； 克隆動物是否會記住供體細胞的年齡?？寺游锸欠駮涀」w細胞的年齡。 克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因?？寺游锏倪B續(xù)后代是否會累積突變基因。 在克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。在克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。 40教育教學 實踐問題實踐問題 克隆動物的成功率還很低克隆動物