在MJChromo4實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量RTqPCR對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析

1、在MJ Chromo4實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量（RT-qPCR）對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析反轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)具有很高的靈敏性和非常好的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，為基因表達(dá)分析提供了一個(gè)基準(zhǔn)。應(yīng)用這一技術(shù)可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的方法，如溴化乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)能夠?qū)ζ鹗济暹M(jìn)行定量，與傳統(tǒng)方法相比實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)顯出了極大的優(yōu)勢(shì)。所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)

2、，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖(如圖1)。圖1實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量

3、之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（threshold value）（如圖2所示）。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始

4、拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（如圖3所示）。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 圖3 閾值線和CT值對(duì)反轉(zhuǎn)錄定量PCR而言，就是定義不同處理或者不同組織間某個(gè)基因初始轉(zhuǎn)錄本的含量，我們可以用含有目標(biāo)基因和看家基因的質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品，生成各自的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線去定量不同樣品中的目的基因的表達(dá)水平。定量的試劑包括與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料和TaqMan探針、分子信標(biāo)等特異性的雜交探針。與DNA雙鏈結(jié)合SYBR-GreenI(SG)染料因使用簡(jiǎn)單而被許多定量實(shí)驗(yàn)采用。SG是一種特異結(jié)合雙鏈DNA的染料，已被證明能靈敏的檢測(cè)核酸。SG結(jié)合雙鏈DNA后熒光

5、增強(qiáng)1000倍左右，極為適合檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由于SG能結(jié)合于所有雙鏈，因而不能特異性的檢測(cè)某一特定模板。使用雜交探針要求細(xì)心設(shè)計(jì)引物組，而SG僅需要兩個(gè)用于擴(kuò)增的引物，無(wú)需對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。DyNAzymesII聚合酶在多種擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生了很好的結(jié)果。這種由Thermus brockianus中分離出來(lái)的聚合酶比Taq酶熱穩(wěn)定性更好，能在廣泛的反應(yīng)條件下保持很好的活性。SG對(duì)DyNAzymesII聚合酶的抑制作用更小。本研究的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明使用DyNAzymesII聚合酶和SG能夠精確靈敏的檢測(cè)到噬菌體和人類基因組DNA的初始濃度。材料與方法材料1含有-actin轉(zhuǎn)錄本的RNA樣品2-

6、actin熒光檢測(cè)試劑盒（東勝創(chuàng)新Chromo4裝機(jī)試劑盒）2DyNAmo SGI mix 100l5uM -actin forward primer 20l5uM -actin reverse primer 20l方法定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1將含有-actin基因的質(zhì)粒做系列濃度稀釋，分別為103、104、105、106、107個(gè)拷貝。2建立15l PCR反應(yīng)體系2 DyNAmo SGI mix 7.5l5uM -actin forward primer 1.5l5uM -actin forward primer 1.5lddH2O 3.5l-actin標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 1l每個(gè)樣品做個(gè)重復(fù)SYBR G

7、reen I熒光染料用于基因表達(dá)表達(dá)分析 1滅菌的微量離心管中加入2ng RNA作為模板，在75C加熱5分鐘，迅速置于冰上冷卻。2每一反應(yīng)的反應(yīng)組分如下MgCl2, 25mM* 4lReverse Transcription 10X Buffer 2ldNTP Mixture, 10mM 2lRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5lAMV Reverse Transcriptase (High Conc.) 15uOligo(dT)15 Primer OR Random Primers 0.5gRNA模板 2ngNuclease-Free W

8、ater to a final volume of 20l在42C下 孵育15分鐘-60分鐘。3.上述反應(yīng)液在95C 變性5分鐘，然后在冰上迅速冷卻。4. 建立15l PCR反應(yīng)體系first-strand cDNA reaction 1l2 DyNAmo SGI mix 7.5l5uM -actin forward primer 1.5l5uM -actin forward primer 1.5lddH2O 3.5lNuclease-Free Water to a final volume of 15l PCR反應(yīng)1打開(kāi)Chromo4定量PCR儀2. 將反應(yīng)管置于循環(huán)儀中，進(jìn)行板設(shè)置3如下設(shè)

9、置程序：step 1 94 , 2minstep 96 , 10secstep 63 , 15secstep 72 , 20secstep 5plate readstep 6 84 , 1secstep plate read step 8 Goto step 2,39more timesstep 9 72 , 10minstep 10 Melting curve analysis:65 -95 , 0.2 /read , 1 sec holdstep 11 10,foreverstep 12 開(kāi)始運(yùn)行結(jié)果分析1 繪制熔解曲線隨著溫度的升高與雙鏈接連結(jié)合的SG釋放，熒光信號(hào)也隨之平滑的下降。熒光

10、強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)也被顯示。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)（熔點(diǎn)，Tm）處清晰地看到了一個(gè)單一的峰。這個(gè)峰對(duì)應(yīng)著擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度，表明特異擴(kuò)增了-actin。熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖中如沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和假陽(yáng)性現(xiàn)象。2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線C(t)值（熒光曲線與域值線交叉的點(diǎn)）隨著初始模板濃度的增加而成比例的減少，這是因?yàn)槌跏寄０鍧舛雀叩臉悠犯斓纳勺阋员籗G檢測(cè)到的數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)與對(duì)應(yīng)的C(t)值成正比，具有極好的線形關(guān)系。3 未知樣品中-actin基因轉(zhuǎn)錄本的定量分析對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照初始模板量與C(t)的線性關(guān)系，可輕松對(duì)-actin基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。計(jì)算每ng總RNA中-actin的拷貝數(shù)。討論實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N方法，本實(shí)驗(yàn)中所做的是對(duì)一個(gè)樣品中基因表達(dá)的絕對(duì)定量。研究人員在設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)分析基因表達(dá)的時(shí)候首先要問(wèn)的一個(gè)問(wèn)題就是：數(shù)據(jù)最后會(huì)以一個(gè)什么樣的形式得到。如果需要知道絕對(duì)的拷貝數(shù)，就必須用絕對(duì)定量的方法，否則只需要給出基因表達(dá)相對(duì)量就足夠了。相對(duì)定量可能比絕對(duì)定量要更容易一些，因?yàn)樗恍枰鳂?biāo)準(zhǔn)曲線。本文所給出的公式對(duì)于每個(gè)用相對(duì)定量的方法分析基因表達(dá)差異的研究人員都足夠了。下面，我們總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和評(píng)估中的一