《色譜的定性與定量》ppt課件

1、 1 1、利用保管值定性、利用保管值定性 鑒別每個色譜峰鑒別每個色譜峰 經過比較保管值經過比較保管值( (通常是保管時間通常是保管時間) )的方法，找到各的方法，找到各 色譜峰所對應的組份色譜峰所對應的組份 大多數情況下用比較保管時間來定性大多數情況下用比較保管時間來定性 即所謂：即所謂： 保管時間一樣，能夠是同樣的組份保管時間一樣，能夠是同樣的組份 保管時間不同，一定不是同樣的組份保管時間不同，一定不是同樣的組份 利用知物直接對照進展定性分析利用知物直接對照進展定性分析 通常做法：把未知物和知規(guī)范物在同一根色通常做法：把未知物和知規(guī)范物在同一根色 譜柱上，用一樣的色譜操作條件進展分析，記譜柱

2、上，用一樣的色譜操作條件進展分析，記 錄色譜圖后利用保管時間進展比對錄色譜圖后利用保管時間進展比對 為防止載氣流速和溫度變化引起保管時間的為防止載氣流速和溫度變化引起保管時間的 變化，可用相對保管值定性或用知物添加峰高變化，可用相對保管值定性或用知物添加峰高 法定性法定性 知物添加峰高法定性原理：在得到未知樣品知物添加峰高法定性原理：在得到未知樣品 的色譜圖后，往未知樣品中參與一定量的知物的色譜圖后，往未知樣品中參與一定量的知物 質，在同樣色譜條件下的兩色譜圖對比圖譜比質，在同樣色譜條件下的兩色譜圖對比圖譜比 較峰高。較峰高。 定義：相對保管值是組分定義：相對保管值是組分i與基準物與基準物S的

3、調整保管值之比：的調整保管值之比： 優(yōu)點：可以消除某些操作條件的影響，只需柱溫、固定相不優(yōu)點：可以消除某些操作條件的影響，只需柱溫、固定相不 變，即使柱徑、柱長、填充情況及流動相的流速有所變化，變，即使柱徑、柱長、填充情況及流動相的流速有所變化， 相對保管值相對保管值依然不變，它是色譜定性分析的重要參數依然不變，它是色譜定性分析的重要參數 sR,iR,sR,iR,si, /VVtt 利用保管指數定性利用保管指數定性 表示物質在固定液上的保管行為，是目前運表示物質在固定液上的保管行為，是目前運 用最廣泛并被國際上所公認的定性參數，它具用最廣泛并被國際上所公認的定性參數，它具 有定性可靠，重現性好

4、，規(guī)范一致等優(yōu)點。有定性可靠，重現性好，規(guī)范一致等優(yōu)點。 可將儲存在計算機中的規(guī)范保管指數轉換可將儲存在計算機中的規(guī)范保管指數轉換 成用戶色譜條件下的保管指數和保管時間成用戶色譜條件下的保管指數和保管時間tRtR A A定義定義 B B保管指數的測定保管指數的測定 保管指數的準確度和重現性都很好，用同一色譜柱測定保管指數的準確度和重現性都很好，用同一色譜柱測定 誤差小于誤差小于1%1%，因此只需柱溫暖固定液一樣，就可以用文獻，因此只需柱溫暖固定液一樣，就可以用文獻 上發(fā)表的保管指數定性。上發(fā)表的保管指數定性。 lglg lglg 100 ZRnZR ZRxR X tt tt nZI 1 lgl

5、g lglg 100 ZRZR ZRxR X tt tt ZI 保管值定性的主要方法 直接與知規(guī)范物對照 某一未知峰和知規(guī)范物的保管值完全相 同能 夠是 改動色譜柱或流動相，保管時間仍完全一樣根 本是 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .3 0 0 .3 5 0 .4 0 0 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0 A U M in u te s U ra c il E th y lp a ra b e

6、n P ro p y lp a ra b e n 利用文獻的數據進展對比和定性分析利用文獻的數據進展對比和定性分析 留意留意HPLCHPLC的柱填充技術的復雜性，定性的柱填充技術的復雜性，定性 遭到限制遭到限制 最簡單的方法：規(guī)最簡單的方法：規(guī) 范添加法范添加法 前提：要有規(guī)范物前提：要有規(guī)范物 判別的規(guī)范：參與判別的規(guī)范：參與 規(guī)范樣后，使未知規(guī)范樣后，使未知 樣色譜峰增高，改樣色譜峰增高，改 動色譜條件，未知動色譜條件，未知 峰仍能增高峰仍能增高 同時用其他方法同時用其他方法 其他色譜方法改動機理，如：用不同的色譜柱其他色譜方法改動機理，如：用不同的色譜柱 其他檢測器其他檢測器 PDA，光

7、譜圖比較、譜庫檢索，光譜圖比較、譜庫檢索 確認色譜峰的純度確認色譜峰的純度 - 保證每個色譜峰下只需一個被測的組份保證每個色譜峰下只需一個被測的組份 -檢查能否有共流出的物質雜質干擾檢查能否有共流出的物質雜質干擾 色譜峰純度確認的方法色譜峰純度確認的方法 -用光電二極管矩陣檢測器比較光譜圖用光電二極管矩陣檢測器比較光譜圖 -峰純度鑒定，四波長比例峰純度鑒定，四波長比例 MS，質譜圖解析、譜庫檢索，質譜圖解析、譜庫檢索 其他儀器方法其他儀器方法 定性方法：比較未知組分和知規(guī)范物質的比移值定性方法：比較未知組分和知規(guī)范物質的比移值 影響比移值的要素：固定相的性質、展開劑的性質、影響比移值的要素：固

8、定相的性質、展開劑的性質、 被分別組分的性質、展開時的溫度等被分別組分的性質、展開時的溫度等 本卷須知本卷須知 展開槽應密閉展開槽應密閉 沿分別軌跡固定相與流動相無梯度變化沿分別軌跡固定相與流動相無梯度變化 展開劑的前沿位置能正確測定展開劑的前沿位置能正確測定 聯機定性是指把色譜和質譜、紅外、紫外 和核磁共振法結合運用 聯用方式： 第一種：先搜集色譜分別后的組分，再用“四 大譜的方法進展定性分析 第二種：經過“接口技術直接把色譜和“四 大譜儀器銜接起來，對每一被分別的組分 進展定性分析 定量分析的詳細內容定量分析的詳細內容 確定樣品的類型，主要成分確定樣品的類型，主要成分/痕量成分痕量成分 使

9、分析條件的分別度使分析條件的分別度R大于：大于：1.5 色譜峰的定性，峰一致性測定色譜峰的定性，峰一致性測定 檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍 用標樣建立規(guī)范曲線用標樣建立規(guī)范曲線 檢查方法的準確度及準確度檢查方法的準確度及準確度 用標樣定期檢查方法用標樣定期檢查方法 1.1.定量分析的根本公式定量分析的根本公式 定量分析的目的：定量分析的目的： 要確定樣品中某一組分的準確含量，是一要確定樣品中某一組分的準確含量，是一 種相對的定量方法種相對的定量方法 定量分析的方法：定量分析的方法： 在某些限定條件下，檢測器呼應值色在某些限定條件下，檢測器呼應值色 譜

10、峰的峰面積或峰高譜峰的峰面積或峰高-所測組分的數量或所測組分的數量或 濃度成正比，濃度成正比， 即：即： 式中：式中： 組分組分i i的質量的質量 組分組分i i的濃度的濃度 組分的校正因子與檢測器的性質和被組分的校正因子與檢測器的性質和被 測組分的性質有關測組分的性質有關 組分組分i i的峰面積，的峰面積， 組分組分i i的峰高的峰高 iiiii hAfCw No Image i f i c i w i A i h 1 1對稱峰的峰高和峰面積對稱峰的峰高和峰面積 的測定的測定 第一法：峰高半高第一法：峰高半高 峰寬峰寬 式中：式中： h h從峰頂到峰底線從峰頂到峰底線 的垂直間隔的垂直間隔

11、W h/2 W h/2峰高峰高1/21/2處處 的峰寬的峰寬 2 h WhA 第二法：三角形法第二法：三角形法 式中：式中：BMBM三角形的高三角形的高 Wi Wi三角形三角形KMLKML的的 半高寬，近似等于色半高寬，近似等于色 譜峰高譜峰高0.6070.607處的峰寬處的峰寬 i WBMA 85.015.0 2 1 bbhA 2)2)不對稱峰峰高和峰面積的丈不對稱峰峰高和峰面積的丈 量量 第一法：峰高峰寬的平均值第一法：峰高峰寬的平均值 式中：式中：hh峰頂到峰底線的垂峰頂到峰底線的垂 直間隔直間隔 b0 .15+b0.85)b0 .15+b0.85)峰高峰高 0.150.15處和峰高處和

12、峰高0.850.85處的峰寬處的峰寬 平均值平均值 第二法：峰分割計算后加和法第二法：峰分割計算后加和法 A=A1+A2 A=A1+A2 =h1 =h1b1+h2b1+h2b2b2 第三法：大峰上的小峰峰面積的丈量第三法：大峰上的小峰峰面積的丈量 第四法：基線漂移時色譜峰峰面積的丈量第四法：基線漂移時色譜峰峰面積的丈量 第五法：重疊峰峰面積的丈量第五法：重疊峰峰面積的丈量 1 1絕對校正因子絕對校正因子fi)fi) fi fi的物理意義的物理意義: :單位峰面積所代表的單位峰面積所代表的I I組分的量組分的量, , 是一個與是一個與i i組分的物理化學性質和檢測器的性質組分的物理化學性質和檢測

13、器的性質 有關的常數有關的常數 定量校正定量校正 因子的計算公式為：因子的計算公式為： 留意留意: :峰高定量校正因子峰高定量校正因子fi(h)fi(h)受操作條件影響較大受操作條件影響較大 ii ii i hA cm f 絕對校正因子絕對校正因子fifi的大小主要由操作條件和的大小主要由操作條件和 儀器的靈敏度所決議，既不容易準確丈量，也儀器的靈敏度所決議，既不容易準確丈量，也 無一致規(guī)范；當操作條件動搖時，無一致規(guī)范；當操作條件動搖時，fifi也發(fā)生變也發(fā)生變 化。故化。故fifi無法直接運用，定量分析時，普通采無法直接運用，定量分析時，普通采 用相對校正因子。用相對校正因子。 2 2相對

14、校正因子校正因子：相對校正因子校正因子： 式中：式中：f - f - 相對校正因子相對校正因子 ，簡稱為校正因子，簡稱為校正因子， 無因次量無因次量 fi , fsi fi , fsi 物質、基準物質物質、基準物質s s的質量的質量 或濃度或濃度) ) Ai(hi),As(hs)- Ai(hi),As(hs)-物質、基準物質的峰面物質、基準物質的峰面 積或峰高積或峰高 ss ss ii ii s i hA cm hA cm f f f 質量校正因子質量校正因子(fm)(fm) 定義：當物質量用質量來表示時的校正因定義：當物質量用質量來表示時的校正因 子稱為質量校正因子子稱為質量校正因子 (fm

15、), (fm),表示單位峰面積所代表示單位峰面積所代 表的組分質量，質量普通用表的組分質量，質量普通用 g g 或或 mg mg 表示表示. . 式中：式中：mi , ms-mi , ms-被測物質、基準物質的質量被測物質、基準物質的質量 Ai , As- Ai , As-被測物質、基準物質的峰面積被測物質、基準物質的峰面積 s s i i m A m A m f 摩爾校正因子摩爾校正因子(fM) (fM) 定義：物質的量用摩爾數表示，表示單位峰面積所定義：物質的量用摩爾數表示，表示單位峰面積所 代表的組分摩爾數代表的組分摩爾數 式中：式中：Mi , Ms-Mi , Ms-被測物質、基準物質的

16、摩爾質量被測物質、基準物質的摩爾質量 i s m isi sis M M M f MmA MmA f 體積校正因子體積校正因子fvfv 定義：物質的量用體積表示定義：物質的量用體積表示, ,表示單位峰面表示單位峰面 積所代表的組分體積。積所代表的組分體積。 式中：式中：Vi , VsVi , Vs表示被測物質、基準物質的體表示被測物質、基準物質的體 積積 s s i i V A V A V f (3)(3)相對呼應值相對呼應值ss 相對呼應值是物質相對呼應值是物質i i與規(guī)范物質與規(guī)范物質S S的呼應值靈的呼應值靈 敏度之比。單位一樣時，與校正因子互為倒數，敏度之比。單位一樣時，與校正因子互為

17、倒數， 即：即： 與只與試樣、規(guī)范物質以及檢測器類型有關，而與只與試樣、規(guī)范物質以及檢測器類型有關，而 與操作條件和柱溫、載氣流速、固定液性質等無與操作條件和柱溫、載氣流速、固定液性質等無 關，是一個能通用的常數。關，是一個能通用的常數。 樣品的預備：測定校正因子時，要精細稱定適樣品的預備：測定校正因子時，要精細稱定適 量色譜純的被測組分和基準物質，配制成知準確量色譜純的被測組分和基準物質，配制成知準確 濃度的樣品。濃度的樣品。 樣品的測定：在已確定的色譜條件下，取準確樣品的測定：在已確定的色譜條件下，取準確 體積的樣品進樣，從譜圖上獲得準確的峰面積體積的樣品進樣，從譜圖上獲得準確的峰面積 計

18、算：根據相對校正因子的計算公式可以算出計算：根據相對校正因子的計算公式可以算出 質量或摩爾或體積校正因子質量或摩爾或體積校正因子 例：例： 某試樣合有某試樣合有5g乙醇，測得相應的色譜峰面積乙醇，測得相應的色譜峰面積 為為150mm2，求乙醇的，求乙醇的fi。 解：解： 222 10331505 mmgmmgf i ./ 即每平方毫米色譜峰面積代表即每平方毫米色譜峰面積代表3.310-2g乙醇乙醇 例：例： 準確稱取一定質量的色譜純對二甲苯、甲苯、準確稱取一定質量的色譜純對二甲苯、甲苯、 苯及仲丁醇，混合后稀釋，采用氫焰檢測器，定苯及仲丁醇，混合后稀釋，采用氫焰檢測器，定 量進樣并丈量各物質所

19、對應的峰面積，數據如下：量進樣并丈量各物質所對應的峰面積，數據如下： 物質物質 苯苯 仲丁醇仲丁醇 甲苯甲苯 對二甲苯對二甲苯 m/g 0.4720 0.6325 0.8149 0.4547 A/cm2 2.60 3.40 4.10 2.20 以仲丁醇為規(guī)范，計算各物質的相對質量校正因子。以仲丁醇為規(guī)范，計算各物質的相對質量校正因子。 2 cm40. 3 6325. 0g fm 仲丁醇仲丁醇 2 cm. . 104 81490g f m 甲苯 061 403 63250 104 81490 2 2 . . . . . cm g cm g f f f m m m 仲丁醇 甲苯 甲苯 061 63

20、250 81490 104 403 . . . . . m m m （仲丁醇） （甲苯） （甲苯） （仲丁醇） （仲丁醇） （甲苯） 甲苯 m m A A f f f 101980. 對二甲苯苯 mm ff 1.1.歸一化法歸一化法 定義：把一切出峰的組分含量之和按定義：把一切出峰的組分含量之和按100%100%計的計的 定量方法稱為歸一化法，是一種相對定量方法。定量方法稱為歸一化法，是一種相對定量方法。 前提：樣品中的一切組分都能流出色譜柱，而前提：樣品中的一切組分都能流出色譜柱，而 且在檢測器上一切的組分都能產生信號。且在檢測器上一切的組分都能產生信號。 計算方法：計算方法： 優(yōu)點：歸一化

21、法很直觀，容易接受，計算簡便、優(yōu)點：歸一化法很直觀，容易接受，計算簡便、 準確，當操作條件如進樣量、流速等發(fā)生變化時，準確，當操作條件如進樣量、流速等發(fā)生變化時， 對計算結果的影響很小，是一種常用的計算方法對計算結果的影響很小，是一種常用的計算方法 缺陷：校正因子的測定比較費事，必需一切組分缺陷：校正因子的測定比較費事，必需一切組分 都出峰都出峰 留意：留意： 主要用于主要用于GC的定量測定，當的定量測定，當 fi相近時，可直接相近時，可直接 用峰面積歸一化法。用峰面積歸一化法。 由于檢測技術的影響由于檢測技術的影響,HPLC中很少運用歸一化中很少運用歸一化 內標法：選擇適宜的物質作為待測組分

22、的參內標法：選擇適宜的物質作為待測組分的參 比物，定量加到樣品中去，根據待測組分比物，定量加到樣品中去，根據待測組分 和參比物在檢測器上的呼應值之比和參比和參比物在檢測器上的呼應值之比和參比 物參與量進展定量分析的方法。物參與量進展定量分析的方法。 內標物的選擇原那么：內標物的選擇原那么： A A、內標物必需是原樣品中不存在的物質，其性質盡、內標物必需是原樣品中不存在的物質，其性質盡 量與待測組分相近量與待測組分相近( (同系物、異構體同系物、異構體) ) B B、內標物不能和被測組分起化學反響，要能完全溶、內標物不能和被測組分起化學反響，要能完全溶 于被測樣品中；于被測樣品中； C C、內標

23、物的峰盡能夠接近待測組分的峰，或位于幾、內標物的峰盡能夠接近待測組分的峰，或位于幾 個待測組分的中間，但必需和樣品中的一切峰完個待測組分的中間，但必需和樣品中的一切峰完 全分別；全分別； D D、內標物的參與量應和待測組分相近。、內標物的參與量應和待測組分相近。 待測組分(i)的量mi為： SSSiii AfmAfm S i i SS ii S i A A f Af Af m m S S i ii m A A fm 設樣品的總量為設樣品的總量為m，那么待測組分，那么待測組分i的質量分數為的質量分數為 %100%100 mA mA f m m w S Si i i i 無歸一化法的限制，即只需被

24、測組分能出峰，無歸一化法的限制，即只需被測組分能出峰， 不和其他峰重疊，不論其他組分能否出峰或能不和其他峰重疊，不論其他組分能否出峰或能 否重疊，都可以用內標法進展定量分析否重疊，都可以用內標法進展定量分析 定量準確，受操作條件影響較小定量準確，受操作條件影響較小 可部分補償待測組分在樣品前處置時的損失可部分補償待測組分在樣品前處置時的損失 假設參與幾種內標物，還可提高定量分析的精假設參與幾種內標物，還可提高定量分析的精 度度 內標物的選擇比較困難，同時內標物稱量要求內標物的選擇比較困難，同時內標物稱量要求 準確，操作費事準確，操作費事 假設每次稱取同樣量假設每次稱取同樣量(m)(m)的試樣，

25、每次參與相的試樣，每次參與相 等量等量(ms)(ms)的內標物，那么上式中的內標物，那么上式中m m，msms，fifi均為均為 常數，計算公式可寫為：常數，計算公式可寫為： %100100 mA mA f m m w S Si i S i i 從內標公式可知從內標公式可知 常數 S i S i i A A m m w%100 No Image No Image 0 .0 0 0 .2 0 0 .4 0 0 .6 0 0 .8 0 1 .0 0 1 .2 0 1 .4 0 1 .6 0 1 .8 0 2 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5

26、06 .0 0 v olts M in u te s M ethylP araben E thylP araben P ropylP araben B utylP araben 實踐色譜圖 例例:取二甲苯消費母液取二甲苯消費母液1500mg，母液中合有乙苯、，母液中合有乙苯、 對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯及溶劑和少量苯對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯及溶劑和少量苯 甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作內壬烷作內 標物，測得有關數據如下：標物，測得有關數據如下： 物質物質 壬烷壬烷 乙苯乙苯 對二甲苯對二甲苯 間二甲苯間二甲苯 鄰二甲苯鄰二甲苯 Ai/cm2 98

27、 70 95 120 80 fm 1.02 0.97 1.00 0.96 0.98 求求:各組分的含量。各組分的含量。 解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用內標法計解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用內標法計 算。由各組分的絕對校正因子計算得壬烷、乙苯、算。由各組分的絕對校正因子計算得壬烷、乙苯、 對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的相對校正因子對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的相對校正因子 分別為分別為1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。 根據內標法計算公式，對于乙苯有：根據內標法計算公式，對于乙苯有： %.%.%(796100 150098 15070 950100 m m w i 乙

28、苯） 同樣可以計算出對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的質同樣可以計算出對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的質 量分數分別為量分數分別為9.5%，11.5%，7.84%。 3 3、外標法、外標法 外標法又可分為規(guī)范曲線法和外標一點外標法又可分為規(guī)范曲線法和外標一點 法，是色譜定量分析中比較常用的一種方法，是色譜定量分析中比較常用的一種方 法，是絕對定量方法。法，是絕對定量方法。 計算方法：用濃度峰面積峰高繪制規(guī)范 任務曲線，其斜率即為絕對校正因子，應該 是一條經過原點的直線。 No Image No Image 特點：特點： 簡便、快速、適宜于大量樣品的分析簡便、快速、適宜于大量樣品的分析 無需各組份都被檢出、洗脫無需各組份都被檢出、洗脫 需求標樣需求標樣 標樣及樣品測定的條件要一致標樣及樣品測定的條件要一致 進樣體積要準確，反復性好進樣