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1、2021/3/1712021/3/172本章 內容1. RNA 轉錄的基本過程 2. 轉錄機器的主要成分3. 啟動子與轉錄起始4. 原核與真核生物mRNA的特征比較5. 終止和抗終止6. 內含子的剪接、編輯、再編碼及化學修飾2021/3/173基因表達包括轉錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。 轉錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了TU之外）的RNA單鏈的過程,是基因表達的核心步驟。 翻譯是指以新生的mRNA為模板,把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程,是基因表達的最終目的。2021/3/174 DNA分子中的核苷酸排列順序不但

2、決定了胞內所有RNA及蛋白質的基本結構,還通過蛋白質（酶）的功能間接控制了細胞內全部有效成份的生產、運轉和功能發(fā)揮。 與mRNA序列相同的那條DNA鏈是編碼鏈（coding strand）或稱有意義連（sense strand）,另一條根據(jù)堿基互補原則指導mRNA合成的DNA鏈則被稱為模板鏈（template strand）或稱反義鏈（antisense strand）。2021/3/175DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關系。2021/3/176 DNA和RNA雖然很相似,只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同,但它們的生物學活性卻很不同。 RNA主要以單鏈形式存在于生物體內

3、,其高級結構很復雜,它們既擔負著貯藏及轉移遺傳信息的功能,又能作為核酶直接在細胞內發(fā)揮代謝功能。 因為只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導蛋白質生物合成,所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。2021/3/177生物體內擁有三類RNA 編碼特定蛋白質序列的mRNA;能特異性解讀mRNA 中的遺傳信息并將其轉化成相應氨基酸后加入多肽鏈中的 transfer RNA （tRNA）;直接參與核糖體中蛋白質合成的ribosomal RNA （rRNA）。2021/3/1783. 1 RNA的轉錄的基本過程:無論是原核還是真核細胞,轉錄的基本過程都包括:I

4、.模板識別II. 轉錄起始III. 通過啟動子轉錄的延伸IV. 轉錄的終止。2021/3/179 模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結合的過程。轉錄起始前,啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。 轉錄起始就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產生。I 模板識別模板識別2021/3/1710大腸桿菌中依賴于DNA的RNA轉錄過程圖示。轉錄泡中單鏈DNA的長度約在17bp左右,被聚合酶復合物所保護的DNA序列約為35bp左右。2021/3/1711 真核生物RNA聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū),需要一些被稱為轉錄調控因子的輔助蛋白質

5、按特定順序結合于啟動子上,RNA聚合酶才能與之相結合并形成復雜的前起始復合物（preinitiation transcription complex, PIC）,以保證有效地起始轉錄。2021/3/1712轉錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈是通過啟動子階段,此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū),新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結合不夠牢固,很容易從DNA鏈上掉下來并導致轉錄重新開始。II 轉錄的起始轉錄的起始 (initiation)2021/3/1713 一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū),轉錄就進入正常的延伸階段。所以,通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。 一般說來,通過啟動

6、子的時間越短,該基因轉錄起始的頻率也越高。2021/3/1714 RNA聚合酶離釋放因子,核心酶沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉錄的延伸。 大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動,DNA雙螺旋持續(xù)解開,暴露出新的單鏈DNA模板,新生RNA鏈的3末端不斷延伸,在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。III 轉錄的延伸轉錄的延伸（elongation）2021/3/1715 當RNA鏈延伸到轉錄終止位點時 ,RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵。 RNA-DNA雜合物分離,轉錄泡瓦解 DNA恢復成雙鏈狀態(tài) RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來

7、 IV 轉錄的終止轉錄的終止 （termination）2021/3/171637時,轉錄生成mRNA的速度大約是每分鐘2500個核苷酸,即每秒鐘合成14個密碼子,而蛋白質合成的速度大約是每秒鐘15個氨基酸。正常情況下,從一個基因開始表達到細胞中出現(xiàn)其mRNA的間隔約為2.5分鐘,而再過半分鐘就能在細胞內測到相應的蛋白質。2021/3/17173. 2 轉錄機器的主要成分1. RNA聚合酶 RNA聚合酶是轉錄過程中最關鍵的酶,主要以雙鏈DNA為模板,以4種核苷三磷酸作為活性前體,并以Mg2+/Mn2+為輔助因子,催化RNA鏈的起始、延伸和終止,它不需要任何引物,催化生成的產物是與DNA模板鏈相

8、互補的RNA。2021/3/1718nCapable of polymerization but not initiation（1）RNA polymerase core enzyme2021/3/1719nCore enzyme + sigma factornThe sigma factor is a separate protein required for initiationnThere are many different sigma factorsnDifferent sigma factors allow for the expression of different genes

9、（2）RNA polymerase holoenzymea a2 2bbbbs sa a2 2bbbb + s sholoenzyme core polymerase sigma factor2021/3/1720（3）各個亞基的功能）各個亞基的功能 2021/3/1721Phosphodiester bond formationDNA bindingDNA bindingAssemble holoenzyme因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結合2021/3/1722The five subunits of t h e b a c t e r i a l e n z y m e a r e

10、 distinguished by color. Only the N-terminal domains of the alpha subunits are included in this model.2021/3/1723 核心酶核心酶 （Core Enzyme） 作用于轉錄的延伸過程（終止）作用于轉錄的延伸過程（終止） 依靠靜電引力依靠靜電引力與與DNA模板結合模板結合（蛋白質中堿性（蛋白質中堿性 基團與基團與DNA的磷酸根之的磷酸根之 間）間） 非專一性的結合（與非專一性的結合（與DNA的序列無關）的序列無關） 結合常數(shù)結合常數(shù):1011mol2021/3/1724全酶（全酶（Holo

11、 Enzyme） 用于轉錄的起始用于轉錄的起始 依靠空間結構與依靠空間結構與DNA模板結合模板結合 (與核心酶結合后與核心酶結合后 引起的構象變化引起的構象變化) 專一性地與專一性地與DNA序列序列(啟動子啟動子)結合結合 結合常數(shù)結合常數(shù):1014mol 半衰期半衰期:數(shù)小時數(shù)小時 轉錄效率低轉錄效率低,速度緩慢（速度緩慢（ 的結合的結合 ）2021/3/1725 此外此外,新發(fā)現(xiàn)的一種新發(fā)現(xiàn)的一種亞基的功能尚不清楚。亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點和功能、各亞基的特點和功能 （1） 因子（因子（sigma factor） 因子可重復使用因子可重復使用 修飾修飾RNApolRNApol構

12、型構型 使使Holo Enzyme Holo Enzyme 識別啟動子的識別啟動子的3535區(qū)區(qū), ,并通過并通過與模與模 板鏈結合板鏈結合2 2 2 2（3）全酶的組裝過程）全酶的組裝過程2021/3/1726q因子的作用是負責模板鏈的選擇和轉錄的起始,它是酶的別構效應物,使酶專一性識別模板上的啟動子。核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個結合位點,平均結合常數(shù)為21011。q因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力,酶底結合常數(shù)提高103倍,酶底復合物的半衰期可達數(shù)小時甚至數(shù)十小時。q因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點的結合常數(shù)降低104倍,使酶底復合物的

13、半衰期小于1秒。2021/3/1727大腸桿菌中的大腸桿菌中的因子能識別并與啟動子區(qū)的特因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結合異性序列相結合因子基因功能-35區(qū)間隔（bp）-10區(qū)70rpoD廣泛TTGACA16-18TATAAT32rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTA54rpoN氮代謝CTGGNA6TTGCA2021/3/1728 不同的不同的因子識別不同的啟動子因子識別不同的啟動子 E.coli 中有四種中有四種因子（因子（70、32、54、28） 枯草桿菌中有枯草桿菌中有6種種因子因子 （因子的更替對轉錄起始的調控）因子的更替對轉錄起始的調控）（2）因子

14、因子 核心酶的組建因子核心酶的組建因子 促使促使RNA聚合酶與聚合酶與DNA模板鏈結合酶模板鏈結合酶 2 2 前端前端因子使模板因子使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈雙鏈解鏈為單鏈 尾端尾端因子使解鏈的單鏈因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈重新聚合為雙鏈2021/3/1729 （3） 因子因子 完成核苷酸底物之間的磷酸酯鍵的連接完成核苷酸底物之間的磷酸酯鍵的連接 Editing 功能（排斥與模板鏈不互補的堿基）功能（排斥與模板鏈不互補的堿基） 與與Rho （）因子競爭）因子競爭RNA 3end促進促進RNA聚合酶聚合酶NTP RNA elongation 2021/3/1730 （4） 因子因子 參

15、與參與RNA非模板鏈（非模板鏈（sense strand）的結合）的結合 （充當（充當SSB） 2021/3/1731由于各亞基的功能由于各亞基的功能,使全酶本身含有五個功能位點使全酶本身含有五個功能位點 有義有義DNA鏈結合位點（鏈結合位點（ 亞基提供）亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結合位點（雜交鏈結合位點（亞基提供亞基提供） 雙鏈雙鏈DNA解鏈位點（前端解鏈位點（前端 亞基提供亞基提供） 單鏈單鏈DNA重旋位點（后端重旋位點（后端亞基提供亞基提供） 因子作用位點因子作用位點2021/3/1732Core Enzyme 具有的四個功能位點具有的四個功能位點 DNA/RNA 雜交位點雜交位點

16、() D. S.DNA 解鏈位點解鏈位點() D. S.DNA 重旋重旋() 啟動子識別位點啟動子識別位點 DNA有義鏈結合位點有義鏈結合位點( ) 2021/3/1733nNo proofreading nuclease activitiesn1 error in 105 bpnAbout 105 lower than replicationThe fidelity（保真性）（保真性） of RNA polymerase2021/3/1734 真核生物中的RNA 聚合酶 真核生物中有3類RNA聚合酶,其結構比大腸桿菌RNA聚合酶復雜,它們在細胞核中的位置不同,負責轉錄的基因不同,對-鵝膏覃堿

17、的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14個亞基所組成,相對分子質量超過51052021/3/1735真核生物RNA聚合酶的主要特征 聚合酶中有兩個相對分子質量超過1105的大亞基; 同種生物3類聚合酶有“共享”小亞基的傾向,即有幾個小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。2021/3/1736真核細胞中三類RNA聚合酶特性比較2021/3/1737Ten of the twelve subunits constituting yeast RNA polymerase II are shown in this model. Subunits that are similar in co

18、nformation to those in the bacterial enzyme are shown in the same colors. The C-terminal domain of the large subunit RPB1 was not observed in the crystal structure, but it is known to extend from the position marked with a red arrow.2021/3/17382021/3/1739All three yeast polymerases havefive core sub

19、units homologous , the two and subunits of E. coli RNA polymerase. The largest s u b u n i t ( R P B 1 ) o f R N A polymerase II also contains an essential C-terminal domain (CTD). RNA polymerases I and III contain the same two nonidentical-like s u b u n i t s , w h e r e a s R N A polymerase II co

20、ntains two other nonidentical-like subunits. All three polymerases share the same -like subunit and four other common subunits. In addition, each yeast polymerase contains three to seven unique smaller subunits.2021/3/17402. 轉錄復合物 啟動子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對啟動子的識別,聚合酶與啟動子可逆性結合形成封閉復合物(closed complex),此時,DNA仍處

21、于雙鏈狀態(tài)。 然后,封閉復合物轉變成開放復合物 (open complex),聚合酶全酶所結合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。對于強啟動子來說,從封閉復合物到開放復合物的轉變是不可逆的,是快反應。2021/3/1741 開放復合物與最初的兩個NTP相結合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后即轉變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復合物。除RNA聚合酶之外,真核生物轉錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與。2021/3/1742一般情況下,轉錄起始復合物可以進入兩條不同的反應途徑1. 合成并釋放2-9個核苷酸的短RNA轉錄物,即所謂的流產式起始;2. 盡快釋放亞基,轉錄起始復合物通過

22、上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉錄延伸復合物。2021/3/1743轉錄延伸復合物較為穩(wěn)定,可長時間與DNA模板結合而不解離。只有在遇到轉錄終止信號時,RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸,RNA-DNA雜合物解離,釋放轉錄產物并導致聚合酶本身從模板DNA上脫落。2021/3/17443.3 啟動子與轉錄的起始啟動子與轉錄的起始啟動子(promoter):是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結合形成起始轉錄復合物的區(qū)域 ,它還包括一些調節(jié)蛋白因子的結合位點。2021/3/17453.3.1 原核生物的啟動子原核生物的啟動子I . 轉錄起始點轉錄起始點轉錄起始點在多數(shù)情況下為

23、嘌呤（90%）,常見的序列為CAT, A為轉錄的起始點。2021/3/1746II. -10序列序列 （Pribonow Box）-10序列序列, ,RNARNA聚合酶的牢固結合位點聚合酶的牢固結合位點, ,結合位點（結合位點（B 位點）位點）一致序列一致序列:(:(T80A95T45A60A50T96 ）因此又稱）因此又稱TATA Box位置范圍位置范圍 -18 bp 到到-9 bp保守保守TTATA區(qū)區(qū): :酶的緊密酶的緊密結合結合位點（富含位點（富含AT堿基堿基, ,利于雙鏈打開）利于雙鏈打開） 2021/3/1747III. -35序列序列 （Sextama Box） -35序列,RN

24、A聚合酶的松弛（初始）結合位點 RNA聚合酶依靠其亞基識別該位點 大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上決定了啟動子的強度 位置在不同啟動子中略有變動TTGACA區(qū):提供了提供了RNARNA聚合酶全酶識別的信號聚合酶全酶識別的信號 2021/3/1748IV. -10區(qū)和區(qū)和-35區(qū)間距離區(qū)間距離 在90%的原核生物中為 16到18bp 適宜的距離能為 RNA聚合酶提供合適的空間結構,便于轉錄的起始。 典型的原核生物的啟動子結構為 -35, 1619bp的間隔區(qū), -10區(qū)和區(qū)和 轉錄轉錄 起始點起始點, -10區(qū)到轉錄起始點的距離區(qū)到轉錄起始點的距

25、離 為為 7bp。2021/3/1749大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)2021/3/1750 RNA polymerase scans DNA linearly Slides along DNA without opening strands Detects sequences of -10 and -35 in the major groove Sigma factor allows RNA polymerase to bind to promoter3.3.2 原核生物轉錄的起始原核生物轉錄的起始 2021/3/1751 A. 全酶與啟動子結合的封閉型啟動子復合物的形成全酶與啟動

26、子結合的封閉型啟動子復合物的形成 （ R位點被位點被因子發(fā)現(xiàn)并結合因子發(fā)現(xiàn)并結合 ） B.開放型啟動子復合物的形成開放型啟動子復合物的形成 RNApol的一個適合位點到達的一個適合位點到達10序列區(qū)域序列區(qū)域,誘導富誘導富 含含AT的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”, 形成形成1217bp的泡狀物的泡狀物,同時同時酶分子向酶分子向10序列轉移并與之牢固結合序列轉移并與之牢固結合 開放型啟動子復合物使開放型啟動子復合物使RNA聚合酶定向聚合酶定向 兩種復合物均為二元復合物（全酶和兩種復合物均為二元復合物（全酶和DNA ）2021/3/1752 c. 在開放型的啟動子復合物中在開放型的啟動子

27、復合物中,RNApol的的I位點和位點和E位點的位點的 核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ 亞基）亞基） 三元復合物形成三元復合物形成 +1位多為位多為CAT模式模式,位于離開保守位于離開保守T 69 個核苷酸處個核苷酸處 -6-9 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-19 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4） 因子解離因子解離 核心酶與核心酶與DNA的親和力下降的親和力下降 起始過程結束起始過程結束核心酶移動進入延伸過程核心酶移動進入延伸過程2021/3/1753轉錄的起始過程轉錄的起始過程核心酶核心酶1217bp

28、2021/3/1754（亞基）亞基）2021/3/1755啟動子各位點與轉錄效率的關系啟動子各位點與轉錄效率的關系（1）35 序列與序列與10 序列與轉錄效率的關系序列與轉錄效率的關系 標準啟動子標準啟動子 35 TTGACA 10 TATAAT2021/3/1756不同的啟動子的區(qū)別不同的啟動子的區(qū)別: a. 與標準啟動子序列同源性越高與標準啟動子序列同源性越高 啟動強度越大啟動強度越大 b. 與標準啟動子同源性越低與標準啟動子同源性越低 啟動強度越小啟動強度越小 c. 與標準啟動子差異很大時與標準啟動子差異很大時 由另一種由另一種因子啟動因子啟動 原因原因 -35序列通過被序列通過被 因子

29、識別的容易程度因子識別的容易程度決定啟動子強決定啟動子強度度 -10序列影響開放型啟動子復合物形成的速度序列影響開放型啟動子復合物形成的速度 決定啟決定啟動子強度動子強度 2021/3/1757 （2 2） 3535序列與序列與1010序列的間隔區(qū)與轉錄效率的關系序列的間隔區(qū)與轉錄效率的關系 堿基序列并不重要堿基序列并不重要 間距非常重要間距非常重要, ,17bp17bp的間距轉錄效率最高的間距轉錄效率最高 間距上的突變種類間距上的突變種類: : 間距趨向于間距趨向于17bp 17bp 上升突變上升突變 間距遠離間距遠離17bp 17bp 下降突變下降突變2021/3/1758 1、 RNA聚

30、合酶的啟動子 結構最復雜 位于轉錄起始點的上游,有多個短序列元件組成 通用型啟動子（無組織特異性）（1）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于-25 -30處 一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37)定位轉錄起始點的功能 ,類似原核生物的-10序列的序列的Pribnow框TATA框是絕大多數(shù)真核基因的正確表達所必需的 3.3.3 真核生物的啟動子真核生物的啟動子2021/3/1759（2） CAAT框（CAAT box） 位于-70-80區(qū)處 一致序列為GGC/TCAATCT 前兩個 G 的作用十分重要(轉錄效率) 增強啟動

31、子的效率、頻率,不影響啟動子的特異性（3） GC框（GC box） 在-80-110區(qū),含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（4） 帽子位點 轉錄起始位點,堿基大多為A 以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在2021/3/1760RNA聚合酶的啟動子結構2021/3/1761 （5 5）增強子（）增強子（enhancer）: :能強化轉錄起始的序列為增強子能強化轉錄起始的序列為增強子或強化子。又稱遠上游序列（或強化子。又稱遠上游序列（far upstream sequence）它是遠）它是遠距離調節(jié)啟動子以增加轉錄速率的距離調節(jié)啟動子以增加轉錄速率的DNADNA序列序列, ,其增強作用

32、與序其增強作用與序列的方向無關列的方向無關, ,與它在基因的上下游位置無關。增強子有強與它在基因的上下游位置無關。增強子有強烈的細胞類型選擇烈的細胞類型選擇, ,即不同細胞類型即不同細胞類型, ,增強作用不同。增強作用不同。2021/3/1762Binding of Activator Factors Finally, high-level transcription is induced by the binding of activator factors to DNA sequences called enhancers. Single or multiple copies in eithe