第三節(jié)基因工程的基本操作程序1

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的獲?。┠康幕虻墨@取 （2） （3）將目的基因?qū)胧荏w細胞）將目的基因?qū)胧荏w細胞 （4）目的基因的檢測與鑒定）目的基因的檢測與鑒定基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1.基因文庫：基因文庫：將含有某種生物不同基將含有某種生物不同基因的因的許多許多dna片斷片斷，導(dǎo)入到導(dǎo)入到中中，各個受體菌分別含有這種，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸旎蛭膸?基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分基因文庫（cdna文庫）文庫）基因組基因組文庫與文庫與部分基

2、部分基因文庫因文庫的關(guān)系的關(guān)系基因組文庫的構(gòu)建模式基因組文庫的構(gòu)建模式圖圖通過對通過對受體菌受體菌的培養(yǎng)的培養(yǎng)而儲存而儲存基因基因 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的以目的基因轉(zhuǎn)錄成的 為模板，為模板，在在反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈dna，然后在，然后在dna聚合酶的作用下合成雙聚合酶的作用下合成雙鏈鏈dna，即，即 ，從而獲得所需的基因。，從而獲得所需的基因。（2 2）反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法（cdnacdna文庫的構(gòu)建方法文庫的構(gòu)建方法）mrnacdna基因組基因組dnadna文庫文庫cdnacdna文庫文庫基因組基因組dnadna文庫與文庫與cdnacdna文庫的比較文

3、庫的比較小小大大無無有有無無有有某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全部基因某種生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；如：根據(jù)基因的核苷酸序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置； 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna； 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。u基因文庫基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，中不是直接保管相應(yīng)基因，而是而是保存受體菌保存受體菌，菌中含基因。，菌中含基因。 概念：概念：pcrpcr全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物

4、_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 原理：原理：_聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段dnadna復(fù)制復(fù)制n 過程：過程：變性、退火、延伸三步曲變性、退火、延伸三步曲變性：變性：加熱至加熱至90909595雙鏈雙鏈dnadna解鏈成解鏈成為單鏈為單鏈dnadna退火：退火：冷卻至冷卻至55556060部分引物與模部分引物與模板的單鏈板的單鏈dnadna的特定的特定互補部位相配對和互補部位相配對和結(jié)合結(jié)合延伸：延伸：加熱至加熱至70707575以目的基因為以目的基因為模板，合成互補的模板，合成互補的新新dnadna鏈鏈變性變性退火退火延伸延伸模板dna95p

5、cr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過程pcr的特點50引物1引物2dna引物pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過程pcr的特點引物1引物2dna引物72taq酶taq酶pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過程pcr的特點72第1輪結(jié)束第2輪開始pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過程pcr的特點955072taqtaqtaqtaqpcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過程pcr的特點72第2輪結(jié)束pcr的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性90-95c延伸延伸70-75c退火退火55-60cpcrpcr總結(jié)：總結(jié)： 概念：概念：pcrpcr全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_

6、的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 前提條件：前提條件：_； 原料：原料：_、_ _ 、 _、 _。原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段dnadna復(fù)制復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸dnadna引物引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定dnadna聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增模板模板dnadna思考？思考？1 1個個dnadna分子進行分子進行pcrp

7、cr擴增擴增, ,循環(huán)循環(huán)4 4次，次，理論上至少需要幾個引物？理論上至少需要幾個引物？2（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù)為循環(huán)次數(shù))（24-1）2=30pcr技術(shù)擴增與技術(shù)擴增與dna復(fù)制的比較復(fù)制的比較pcrpcr技術(shù)技術(shù)dnadna復(fù)制復(fù)制相相同同點點原理原理原料原料條件條件不不同同點點解旋解旋方式方式場所場所堿基互補配對堿基互補配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶dnadna在高溫下在高溫下變性解旋變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細胞核內(nèi)細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的dnadna聚合酶聚合酶 細胞內(nèi)的細胞內(nèi)的dnadna聚合酶聚合酶大量的大量的dnadna片段片

8、段形成整個形成整個dnadna分子分子 根據(jù)已知蛋白質(zhì)根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的出相應(yīng)的mrnamrna序列，序列，然后按照堿基互補配然后按照堿基互補配對原則，推測出它的對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學方法，列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合以單核苷酸為原料合成目的基因成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mrnamrna的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化學合成（三）化學方法人工合成目的基（三）化學方法人工合成目的基因因從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取利用利用pcrpcr技術(shù)擴增技術(shù)擴增利用化學方法人工合成利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法真題演練 （2012海南）已知甲種植物因受到乙種昆蟲危害而減產(chǎn)，乙種昆蟲食用某種原核生物分泌的丙種蛋白后死亡。因此可以將丙種蛋白質(zhì)的