第三節(jié)基因工程的基本操作程序1

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 （1）目的基因的獲?。┠康幕虻墨@取 （2） （3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （4）目的基因的檢測(cè)與鑒定）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1.基因文庫(kù)：基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基將含有某種生物不同基因的因的許多許多dna片斷片斷，導(dǎo)入到導(dǎo)入到中中，各個(gè)受體菌分別含有這種，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)基因文庫(kù) 基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cdna文庫(kù)）文庫(kù)）基因組基因組文庫(kù)與文庫(kù)與部分基

2、部分基因文庫(kù)因文庫(kù)的關(guān)系的關(guān)系基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖圖通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)受體菌受體菌的培養(yǎng)的培養(yǎng)而儲(chǔ)存而儲(chǔ)存基因基因 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的以目的基因轉(zhuǎn)錄成的 為模板，為模板，在在反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈dna，然后在，然后在dna聚合酶的作用下合成雙聚合酶的作用下合成雙鏈鏈dna，即，即 ，從而獲得所需的基因。，從而獲得所需的基因。（2 2）反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法（cdnacdna文庫(kù)的構(gòu)建方法文庫(kù)的構(gòu)建方法）mrnacdna基因組基因組dnadna文庫(kù)文庫(kù)cdnacdna文庫(kù)文庫(kù)基因組基因組dnadna文庫(kù)與文庫(kù)與cdnacdna文庫(kù)的比較文

3、庫(kù)的比較小小大大無(wú)無(wú)有有無(wú)無(wú)有有某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全部基因某種生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；如：根據(jù)基因的核苷酸序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置； 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna； 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。u基因文庫(kù)基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，中不是直接保管相應(yīng)基因，而是而是保存受體菌保存受體菌，菌中含基因。，菌中含基因。 概念：概念：pcrpcr全稱(chēng)為全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物

4、_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 原理：原理：_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段dnadna復(fù)制復(fù)制n 過(guò)程：過(guò)程：變性、退火、延伸三步曲變性、退火、延伸三步曲變性：變性：加熱至加熱至90909595雙鏈雙鏈dnadna解鏈成解鏈成為單鏈為單鏈dnadna退火：退火：冷卻至冷卻至55556060部分引物與模部分引物與模板的單鏈板的單鏈dnadna的特定的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合結(jié)合延伸：延伸：加熱至加熱至70707575以目的基因?yàn)橐阅康幕驗(yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的模板，合成互補(bǔ)的新新dnadna鏈鏈變性變性退火退火延伸延伸模板dna95p

5、cr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過(guò)程pcr的特點(diǎn)50引物1引物2dna引物pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過(guò)程pcr的特點(diǎn)引物1引物2dna引物72taq酶taq酶pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過(guò)程pcr的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始pcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過(guò)程pcr的特點(diǎn)955072taqtaqtaqtaqpcr的基本原理pcr反應(yīng)條件pcr過(guò)程pcr的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束pcr的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性90-95c延伸延伸70-75c退火退火55-60cpcrpcr總結(jié)：總結(jié)： 概念：概念：pcrpcr全稱(chēng)為全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_

6、的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 前提條件：前提條件：_； 原料：原料：_、_ _ 、 _、 _。原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增為擴(kuò)增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定dnadna片段片段dnadna復(fù)制復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸dnadna引物引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定dnadna聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增模板模板dnadna思考？思考？1 1個(gè)個(gè)dnadna分子進(jìn)行分子進(jìn)行pcrp

7、cr擴(kuò)增擴(kuò)增, ,循環(huán)循環(huán)4 4次，次，理論上至少需要幾個(gè)引物？理論上至少需要幾個(gè)引物？2（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù)為循環(huán)次數(shù))（24-1）2=30pcr技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與dna復(fù)制的比較復(fù)制的比較pcrpcr技術(shù)技術(shù)dnadna復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原理原理原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場(chǎng)所場(chǎng)所堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶dnadna在高溫下在高溫下變性解旋變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的dnadna聚合酶聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的dnadna聚合酶聚合酶大量的大量的dnadna片段片

8、段形成整個(gè)形成整個(gè)dnadna分子分子 根據(jù)已知蛋白質(zhì)根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的出相應(yīng)的mrnamrna序列，序列，然后按照堿基互補(bǔ)配然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合以單核苷酸為原料合成目的基因成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mrnamrna的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成（三）化學(xué)方法人工合成目的基（三）化學(xué)方法人工合成目的基因因從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取利用利用pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法真題演練 （2012海南）已知甲種植物因受到乙種昆蟲(chóng)危害而減產(chǎn)，乙種昆蟲(chóng)食用某種原核生物分泌的丙種蛋白后死亡。因此可以將丙種蛋白質(zhì)的