HIV實驗室質量管理

1、艾滋病實驗室質量管理實驗室質量管理行政支持 行政部門和領導 HIV實驗室建設和發(fā)展 資金 人員 監(jiān)督支持人員培訓 每年市疾控中心組織 上崗證環(huán)境條件：實驗室的設置及其建筑、設施、設備必須符合全國艾滋病檢測工作管理辦法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清學檢測在滿足實驗室管理要求和保證生物安全的條件下，可以與HIV檢測共享空間和設備，應避免交叉污染。實驗室質量管理樣品采集、運送和處理送檢單收樣登記表HIV抗體復檢檢測單檢測方法和試劑的選擇試劑的出入庫及使用記錄供應品、耗材（試劑）質量驗收記錄表實驗室質量管理設備維護與校準儀器設備溫度記錄表儀器設備使用、檢定、維修、維護記錄本強檢計量器具周期檢定（自

2、校）計劃表文件和文件管理實驗原始記錄表結果報告樣品登記和保存（唯一編碼）實驗室質量管理文件和文件管理標準操作程序（SOP）（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運輸；（2）檢測方法和步驟；（3）試劑使用和保存；（4）儀器的使用維護和校準；（5）質量控制要求及程序；（6）結果解釋與報告；（7）保密程序；（8）實驗室數據、相關文件記錄與保存；（9）不確定樣品追蹤和處理；（10）實驗室安全防護及實驗室的清理和消毒。文件存檔（保存10年以上）ELISA實驗影響因素酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素樣品溶血標本及混有紅細胞的血清采用ELISA法檢測易產生假陽性 可能是溶血血清中含有過氧化酶物質（紅細

3、胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使過氧化氫釋放出原生態(tài)氧，從而催化底物四甲基聯苯胺生成可溶性的有色物質，即顯藍色，產生假陽性。輕微溶血沒事，嚴重溶血的標本易產生假陽性。受細菌污染的標本因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產生非特異性顯色而干擾測定結果。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素樣品塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性 ，最好使用真空采血管或抗凝管。（抗凝劑會略有影響，但影響不大）標本凝固不全 在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清

4、，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素按說明書要求，實驗前應取出試劑穩(wěn)定加樣加樣的量要準確 移液器要經常清洗 定期校準加樣位置 孔壁1/3以下 不可濺出 不可產生氣泡必須使用一次性TIP頭，嚴格控制，防止交叉污染先加稀釋液的，加樣時可用移液器孔內吹打混勻移液器的校準可以送檢，可以自校，自校要有SOP有記錄酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素孵育時間 嚴格按照試劑盒說明書操作 容易控制溫度 嚴格按照試劑盒說明書操作 用校準的溫度計監(jiān)測溫度，特

5、別是冬天，避免因溫度過低導致假陰性。封板 孵育時不貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁,難以清洗徹底。恒溫孵育設備的使用與維護校準的溫度計監(jiān)測ELISA反應溫度水浴的尤其要注意水位酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素洗板洗液的量 試劑不同，板孔的大小差異會導致洗液的量的不同，為保證洗的徹底，原則是量足夠多且不會逸出。浸泡時間 嚴格按照試劑盒說明書操作，一般30-60秒，不設置浸泡時間或時間太短，洗脫不徹底的話會產生“花板”。 保持針孔通暢不阻塞 血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機的針孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”。應做好洗板機的維護工作。

6、拍板酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素洗板機的檢定、使用及維護檢定：注液量和殘留量（每孔5微升）使用：設置程序（注液量、洗板次數、浸泡時間、洗板位置）維護：消毒液沖洗，蒸餾水沖洗酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素顯色加底物時，應懸空加液，避免觸及板孔內壁造成交叉污染。應先加底物緩沖液A再加TMB(四甲基聯苯胺)底物B，加入順序不能顛倒。已顯淺藍色的TMB底物堅決不能用。個別試劑要求A、B液先混合后再加。溫度與時間的控制。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素終止及讀板讀板前應保證板孔底部干凈，無異物，無水氣，無氣泡，特別是在冬天。酶標儀不應放置在陽光或強光照射下,操作時室溫宜在1

7、5-30,使用前先預熱15-30 min,測讀板結果會更穩(wěn)定。酶標儀必須檢定 標準板廠家酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的影響因素Cutoff值計算及結果判定注意事項嚴格按照試劑說明書要求的數量做陰、陽性對照根據陰、陽性對照的值判定實驗是否成立嚴格按照試劑說明書要求計算Cutoff值注意空白原始記錄標明空白對照、陽性對照、陰性對照、外部對照以及待檢樣品的位置試劑盒廠家、測定方法、批號、效期操作人員和復核人員姓名（簽名）檢測日期其他（環(huán)境、設備、實驗依據等）注意樣本的溯源性廢棄物處理消毒液（含氯消毒劑、75%乙醇、2%戊二醛）干烤消毒（140 2-3h）高壓蒸汽消毒（121 15-20min）高壓

8、滅菌器檢定：溫度和壓力高壓滅菌器使用效果監(jiān)測：化學指示卡，生物監(jiān)測（嗜熱脂肪桿菌芽孢）ELISA實驗質量控制ELISA的質量控制試劑盒內部對照：試劑盒內部對照質控品即為試劑盒內提供的陽性和陰性對照血清。試劑盒內部對照用于判斷每次實驗的有效性，但不能作為室內質控品使用。每一次檢測臨床樣品時，必須有試劑盒內部對照，而且只能在同批號的試劑盒中使用。內部對照結果無效，必須重新試驗。室內質控品：為非試劑盒組份的外部質控品，是為了監(jiān)控檢測的重復性而設置的，包括強陽性、弱陽性和陰性質控血清。也可以只設置一個弱陽性質控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的23倍為宜。外部質控品的作用是，判斷該批臨床樣品檢測的

9、有效性，因此，每次實驗必須包含室內質控品，其結果無效，必須重新試驗。室內質控品的來源商品化的室內質控品 實驗室自己制備（比較經濟）混合試劑盒內部對照血清，通過做實驗確定陰陽性對照的混合比例，混合，分裝保存?；旌螲IV抗體陽性人血清、HIV抗體陰性人血清，3000轉/分鐘離心15分鐘，0.2m生物濾膜過濾除菌，5630分鐘加熱滅活處理。通過做實驗確定陰陽性血清的混合比例，混合，分裝保存。高濃度商品化室內質控品再稀釋室內質控品的保存一次購買或制備量應該足夠本實驗室至少一年使用等量分裝，可以按單次使用、單日使用、最長一周使用的量確定每個分裝的量不同室內質控品應做好標記，最好使用不同顏色的標簽，以防止

10、混用應存放于-70以下，如無條件則存放于非自動除霜的-20冰箱一旦融解后應存放于2-8，一周后必須棄去，不能重新凍存使用樣品的采集、處理、保存、運送及接收樣品的采集和處理建議用K2EDTA K3EDTA 枸櫞酸鈉的抗凝管采血,不用肝素抗凝管采血血漿 1500-3000r/min離心15min，吸上層血漿血清 室溫自然放置1-2h，待血液凝固、血塊收縮后1500-3000r/min離心15min，吸上層血清樣品的保存建議用1.5ml-2.0ml的螺口凍存管或離心管保存.抗體及抗原檢測的血清或血漿樣品 應存放于-20以下,一周內檢測的樣品2-8 樣品的保存盡量多分裝保存樣品的運送要求樣本量1ml樣

11、本的質量 無嚴重溶血，無微生物污染，無血脂過多，無嚴重黃疸等管子的質量 防漏三層包裝 單管包裝重新采樣樣品的運送要求樣品和送檢單分開專人送樣 專門運送箱（實驗室人員號碼和聯系方式）市疾控確證實驗室血清or血漿2-8度運送或者凍存狀態(tài)下直接運送送樣單要求送樣單打印檢測者/審核者手簽，單位或實驗室蓋章信息完整(真實姓名、送檢人群、身份證號碼、聯系電話、現地址及戶籍地址等)詳細的樣本來源(監(jiān)管場所的具體到哪個監(jiān)管場所)充分利用備注欄規(guī)范性(試劑、cutoff值等)樣品的接收打開包裝，注意生物安全，個人防護核對樣品與送檢單，檢查樣品管有無破損和溢漏記錄 一般記錄，另外記錄有無嚴重溶血，微生物污染、血脂

12、過多及黃疸等情況開蓋 生物安全柜中，個人防護HIV抗體檢測HIV抗體檢測的目的HIV抗體檢測可用于診斷診斷、血液篩查血液篩查、監(jiān)測監(jiān)測等。以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況，包括臨床檢測、自愿咨詢檢測、根據特殊需要進行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。HIV抗體檢測的要點根據目的選擇檢測方法及檢測策略。嚴格遵守實驗室標準操作程序（SOP）。篩查試驗陽性，須做確證試驗。篩查試驗陰性，不應做確證試驗。HIV抗體篩查試驗流程樣 品初篩試驗初

13、篩試驗篩查試劑陽性反應陰性反應復檢試驗復檢試驗原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑一陰一陽均陰性反應均陽性反應確證試驗報告陰性篩查試劑國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準ELISA試劑批批檢合格，在有效期內推薦使用經臨床質量評估敏感性和特異性高的試劑初篩試劑 高敏感性復檢試劑 高特異性篩查樣品血清血漿全血DBS/DPS唾液尿液篩查方法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）第三代試劑 雙抗原夾心法 單純檢測HIV抗體第四代試劑 抗原抗體聯合診斷試劑 同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體 縮短窗口期 注意復檢試劑的選擇注意復檢試劑的選擇化學發(fā)光或免疫熒光試驗快速檢測（RT）篩

14、查試驗的結果報告HIV抗體篩查試驗陰性反應報告為“HIV抗體陰性”HIV抗體篩查試驗陽性反應報告為“HIV抗體待復檢”HIV抗體復檢試驗兩次檢測均陰性報告為“HIV抗體陰性”HIV抗體復檢試驗兩次檢測均陽性或一陰一陽報告為“HIV抗體待確證”HIV感染產婦所生嬰幼兒嬰兒會由于被動攜帶母親的抗體而連續(xù)幾個月至十幾個月出現抗體陽性。嬰兒滿12個月進行第一次HIV抗體檢測。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進行抗體檢測，兩種篩查試劑檢測結果均為陰性反應，報告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測結果出現陽性反應（一種為陰性反應一種為陽性反應或兩種均陽性反應），不能排除感染，應繼續(xù)追蹤隨訪，至兒童滿18個月

15、時再次進行HIV抗體檢測。HIV感染產婦所生嬰幼兒嬰兒滿18個月時應再次進行HIV抗體檢測。使用兩種不同原理或不同廠家篩查試劑進行抗體檢測。兩種篩查試劑的檢測結果均為陰性反應，報告HIV抗體陰性，可排除感染。檢測出現陽性反應（一種為陰性反應一種為陽性反應或兩種均呈陽性反應），進一步進行確證試驗，根據確證試驗的結果判斷是否感染HIV。做好檢測后咨詢。HIV抗體檢測結果解釋HIV抗體陰性未發(fā)生感染（排除“窗口期”）HIV抗體不確定非特異性的反應感染早期感染晚期HIV抗體陽性發(fā)生感染（排除疫苗使用）HIV抗體快速檢測HIV抗體快速檢測快速檢測，是艾滋病實驗室多了一種檢測方法快速檢測，是為了更多更快的

16、發(fā)現感染者快速檢測，不是為了取代實驗室，但不能因為有了實驗室而放棄使用快速檢測快速檢測手段能否成為新型檢測-咨詢模式，或基于醫(yī)療機構的有效的檢測方法-取決于檢測的質量HIV抗體快速檢測方法PA明膠顆粒凝集試驗（PA）：將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用。當待檢樣品含有HIV抗體時，明膠顆粒與抗體發(fā)生凝集反應，根據凝集情況判讀結果。PA試劑有兩種:同時檢測HIV-1和HIV-2抗體以及分別檢測HIV-1和HIV-2抗體。有效試驗必須有陰性和陽性質控。HIV抗體快速檢測方法免疫滲濾試驗免疫滲濾試驗：斑點ELISA和斑點免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗。以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原點狀

17、固定在膜上，加待檢樣品。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10分鐘以內。有效試驗的質控點必須顯色。HIV抗體快速檢測方法免疫層析試驗免疫層析試驗：以硝酸纖維膜為載體，HIV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品（血液或唾液）沿著固相載體遷移，陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質控帶必須顯色。結果判讀嚴格參照試劑說明書反應區(qū)和質控區(qū)均出現紅色條帶為陽性。質控區(qū)有條帶，反應區(qū)無條帶為陰性。質控區(qū)無條帶則實驗無效。HIV抗體快速檢測的外部質控 外部對照質控品，可采用商用質控品或自制質控品。質控品應包含抗體陽性樣品和陰性樣品。自制質控品可使用本室保留的陽性樣品。不能使用酶聯試驗的外部

18、質控品。下列情況需做質量控制：更換試劑批號；更換檢測人員；更換包裝；每個檢測日；更換試劑廠家。 建議：每個檢測日檢測一次陽性和陰性質控品；如果日檢測量大于50份樣品，至少應作2次質控?？焖贆z測的注意事項不提倡個人在家中檢測。應由經培訓的專業(yè)人員操作，注意生物安全操作，避免職業(yè)暴露發(fā)生。在質控窗口內應出現質控帶，如實驗完成后未呈現質控帶，說明試劑盒內質控無效，該試驗結果無效，樣品須重檢。出現以下問題，提示存在質量隱患，應引起重視：運輸包裝、內盒或試劑盒的物理損傷；在單包裝內存在混雜物質；標簽出現錯誤、缺失或字跡模糊 （特別是產品名稱或出產廠家名稱，批號和貨號，失效期或/和生產日期）；缺失目錄；泄

19、漏或污染；不適宜的存放條件；保護包裝紙破損或污染?？焖贆z測的注意事項環(huán)境溫度,尤其是在冬天血清/血漿 全血 稀釋緩沖液樣本的量反應的時間生物安全 廢棄物處理做好實驗的原始記錄不同廠家的快檢試劑操作要求廠家廠家樣品要求樣品要求血量血量(ul)(ul)樣品稀釋樣品稀釋是否加緩是否加緩沖液沖液最小反應最小反應時間時間( (分鐘分鐘) )最大反應最大反應時間時間( (分鐘分鐘) )試劑儲存要試劑儲存要求求明膠顆粒法明膠顆粒法(PA)(PA)血清血清/ /血漿血漿25251:321:32N N120120/ /2-102-10DETERMINEDETERMINE血清血清/ /血漿血漿/ /全血全血5050N N用全血時用全血時加加1 1滴滴151560602-302-30SDSD血清血清1010N NN N5 520201-301-30杭州艾康杭州艾康血清血清/ /血漿血漿/ /全血全血25