色譜法分離原理

1、色譜法分離原理教學內(nèi)容1. 色 譜 分 離 的 基 本 原 理 和 基 本 概 念2. 色 譜 分 離 的 理 論 基 礎3. 色 譜 定 性 和 定 量 分 析 的 方 法重點與難點1. 塔 板 理 論 ， 包 括 流 出 曲 線 方 程 、 理 論 塔 板 數(shù) ( n) 及 有 效 理 論 塔 板 數(shù) (n e f f ) 和 塔 板 高 度 (H ) 及 有 效 塔 板 高 度 (H e f f ) 的 計 算2. 速 率 理 論 方 程3. 分 離 度 和 基 本 分 離 方 程三教學要求1. 熟 練 掌 握 色 譜 分 離 方 法 的 原 理2. 掌 握 色 譜 流 出 曲 線( 色

2、 譜 峰 )所 代 表 的 各 種 技 術 參 數(shù) 的 準 確 含 義3. 能 夠 利 用 塔 板 理 論 和 速 率 理 論 方 程 判 斷 影 響 色 譜 分 離 各 種 實驗因素4. 學 會 各 種 定 性 和 定 量 的 分 析 方 法四.學時安排 4學時第一節(jié) 概述色譜法早在19 03年由俄國植物學家茨維特分離植物色素時采 用。他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳 酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結果色素中各 組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜 法。以后此法逐漸應用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原 來的含義但仍被人們

3、沿用至今。在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體 或液體）稱為固定相；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體） 稱為流動相；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜 柱_。當流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作 用，由于各組分在性質(zhì)和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、 強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留 時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。從不同角度，可將色譜法分類如下：1. 按兩相狀態(tài)分類氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC）根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的薄層有機化合物液體），又可分為氣固色譜

4、（GSC）和氣液色譜（GLC） 液 體 為 流 動 相 的 色 譜 稱 液 相 色 譜 （ LC）同 理 液 相 色 譜 亦 可 分 為 液 固 色 譜 （ LSC） 和 液 液 色 譜 （ LLC） 。超 臨 界 流 體 為 流 動相的色 譜 為 超 臨界流 體 色 譜 （SFC） 。 隨 著色譜工 作 的 發(fā) 展 ， 通 過化 學反 應 將固 定液鍵 合 到 載體表面 ， 這 種 化學鍵合 固 定 相 的 色 譜 又稱化學 鍵 合 相 色譜（ CBPC） .2. 按 分 離 機 理 分類利 用 組 分 在吸 附 劑（ 固 定 相 ）上 的 吸附 能 力 強 弱 不 同 而 得 以 分 離的

5、 方 法 ， 稱 為 吸 附 色 譜 法 。利 用 組 分 在固 定 液（ 固 定 相 ）中 溶 解度 不 同 而 達 到 分 離 的 方 法 稱 為分配色譜法。利 用 組 分 在離 子 交 換 劑（ 固 定 相 ）上 的 親 和 力 大 小 不 同 而 達 到 分離 的 方 法 ， 稱 為 離 子交 換 色 譜 法 。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方 法 ， 稱 為 凝 膠 色 譜 法 或 尺 寸排 阻 色 譜 法 。最 近 ，又 有 一種 新 分 離 技 術 ，利 用 不 同 組 分 與 固 定 相（ 固 定 化 分 子 ）的 高 專 屬 性 親 和 力 進 行 分

6、 離 的 技 術 稱 為 親 和 色 譜 法 ，常 用 于 蛋 白 質(zhì)的分離。3. 按 固 定 相 的 外 型 分 類固 定 相 裝 于柱 內(nèi) 的 色 譜 法 ， 稱為 柱 色 譜 。固 定 相 呈 平板 狀 的 色 譜 ，稱 為 平 板 色 譜 ，它 又 可 分 為 薄 層 色 譜 和 紙色譜4. 按 照 展 開 程 序 分 類按照展開程序的不同，可將色譜法分為洗脫法、頂替法、和 迎 頭 法 。 洗 脫 法 也 稱沖 洗 法 。工 作 時 ， 首 先 將樣 品 加 到色 譜 柱 頭上 ， 然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。 由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被

7、沖洗劑帶出的先 后次序也不同，從而使組分彼此分離。這 種 方 法 能使 樣 品 的 各 組 分 獲得 良 好 的 分 離 ，色 譜 峰 清 晰 。此 外 ，除 去 沖 洗 劑 后 ，可 獲 得純 度 較 高 的 物 質(zhì) 。目 前 ，這 種 方 法 是 色 譜 法 中 最常用的一種方法。頂 替 法 是 將樣 品 加 到 色 譜 柱 頭后 ，在惰 性 流 動 相 中 加 入 對 固 定 相 的 吸 附 或 溶 解 能 力 比所 有 試 樣組 分 強 的 物 質(zhì) 為頂 替 劑（ 或 直 接 用 頂 替 劑 作 流 動 相 ），通 過 色 譜 柱 ，將 各 組 分 按 吸附 或 溶 解能 力 的 強

8、弱 順 序 ， 依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解能力最弱的組分最先流出， 最強的最后流出。此法適于制備純物質(zhì)或濃縮分離某一組分；其缺點是經(jīng)一次使用 后 ，柱 子 就 被 樣 品 或 頂 替 劑 飽 和 ，必 須 更 換 柱 子 或 除 去 被 柱 子 吸 附 的 物 質(zhì) 后 ， 才 能 再 使用 。迎 頭 法 是 將試 樣 混 合 物 連 續(xù) 通過 色 譜 柱 ，吸 附 或 溶 解 能 力 最 弱 的組 分 首 先 一 純 物 質(zhì) 的狀 態(tài) 流 出，其 次則 以 第 一組 分 和 吸 附 或 溶 解 能 力較 弱 的 第 二 組 分 混 合物 ，以 此 類 推 。該 法 在分 離 多 組分

9、 混 合 物 時 ，除第 一 組 分 外 ，其 余 均 非 純 態(tài) ，因 此 僅 適 用 于 從含 有 微 量 雜 質(zhì) 的 混 合 物中 切 割 出 一 個 高 純 組分 （ 組 分 A） ， 而 不 適 用 于對 混 合 物進 行 分 離 。第 二 節(jié) 色 譜 流 出 曲線 及 有 關 術 語（一）色譜流出曲線和色譜峰由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜 流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。如果進樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜） 或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則色譜峰是對稱的。（二）基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲 線稱為基

10、線，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線。（三）峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h）表示?；€（a）峰高（h）（四）保留值1. 死時間t匕不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰 極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速口時，可用柱長L與t 0的比值 計算，即u = L /t o2. 保留時間t r試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時 間3. 調(diào)整保留時間t J某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即t r ' = t r - t 0由

11、于組分在色譜柱中的保留時間t r包含了組分隨流動相通過柱子所須的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以t r實際上是 組分在固定相中保留的總時間。保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受 到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留 值。4. 死體積Vo指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩相很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速Fco (cm? min -1)計算。Vo式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜5. 保留體積V r指從

12、進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：Vr = t r F co6. 調(diào)整保留體積Vr某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。Vr = Vr _ V。= t r Fco7. 相對保留值 r 2,1某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對 保留值。r 2, 1= t r2 / t r1 '= V2/ V1由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關，而與柱徑、柱 長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是在 氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。在定性分析中，通常固定一 個色譜峰作為標準(s)，然后再求其它

13、峰(i )對這個峰的相對保留 值，此時可用符號表示，即:-=t r (i ) /t r(S )式中tr ( i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以總是大于1的 相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子(五) 區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡 量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾?通常有三種方法。1. 標準偏差匚即0. 607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬W1/ 2即峰高一半處對應的峰寬。它與標準偏差的關系為Wh/ 2=2.3 54 二3. 峰底寬度W即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差匚的關系是 W= 4匚

14、從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i) 根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；(ii )根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；(ii i) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；(iv )色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評價色譜柱分離效能的依 據(jù)；（ v） 色 譜 峰 兩 峰 間 的 距 離 ， 是 評 價 固 定 相 （ 或 流 動 相 ） 選 擇 是 否 合 適的依據(jù)。色 譜 分 析 的目 的 是 將 樣 品 中 各組 分 彼 此 分 離 ，組 分 要 達 到 完 全 分 離 ，兩 峰 間 的 距 離 必 須 足 夠 遠 ，兩 峰 間 的 距 離 是 由 組 分 在 兩

15、 相 間 的 分 配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學性質(zhì)有關。第 三 節(jié) 色 譜 法 基 本 原 理（ 一 ） 分 配 系 數(shù) K 和分 配 比 k1. 分 配 系 數(shù) K分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復 多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復多次的吸附-脫附過 程 。這 種 分 離 過 程 經(jīng) 常 用 樣 品 分 子 在 兩 相 間 的 分 配 來 描 述 ，而 描 述 這 種 分 配 的 參 數(shù) 稱 為 分配 系 數(shù) K。它 是 指 在 一 定 溫 度和 壓 力 下 ，組 分 在 固定 相 和 流 動 相 之 間 分 配 達平衡時的濃度之比值，即K= 溶 質(zhì) 在 固

16、 定 相 中 的 濃 度/ 溶 質(zhì) 在 流 動 相 中 的 濃 度 =Cs / Cm分 配 系 數(shù) 是 由 組 分和 固 定 相的 熱 力 學 性 質(zhì) 決定 的 ，它 是 每 一 個 溶質(zhì)的特征值，它僅與兩個變量有關：固定相和溫度。與兩相體積、 柱管的特性以及所使用的儀器無關。2. 分 配 比 k分 配 比 又 稱 容 量 因子 ，它 是 指 在 一 定 溫 度和 壓 力 下，組 分 在 兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。即k =組分在固定相中的質(zhì)量 / 組分在流動相中的質(zhì)量=ms /mmk值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大， 因此又稱分配容量或容量因子。它

17、是衡量色譜柱對被分離組分保留能 力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學性質(zhì)。它不僅隨柱 溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關。k = mt /mk =CsVs / CmVm式中Cs, Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度；Vm為柱中流動 相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同 的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中， 則表示固定相的孔體積。分配比k值可直接從色譜圖中測得(推導過程教材P.2 96 2 97)。k = (t r - t 0 )/ t 0= t r / t 0 = V r / V 04. 分

18、配系數(shù)K與分配比 k的關系K = k .-其中卩稱為相比率，它是反映各種色譜柱柱型特點的又一個參 數(shù)。例如，對填充柱，其卩值一般為635 ;對毛細管柱，其卩值為 6 0 600。4. 分配系數(shù) K及分配比k與選擇因子a的關系對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：a = t r ( B) / t r (A ) = k ( A)/ k ( B) =K ( A)/ K通過選擇因子a把實驗測量值k與熱力學性質(zhì)的分配系數(shù)K直 接聯(lián)系起來，a對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k 值相等，則a =1 ,兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分 的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不

19、同的分配系 數(shù)是色譜分離的先決條件。圖中Ka>Kb ,因此，A組分在移動過程中滯后。隨著兩組分在色 譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大，同時，每一組分的 濃度輪廓（即區(qū)域?qū)挾龋┮猜儗?。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不利 的，但又是不可避免的。若要使A、B組分完全分離，必須滿足以下 三占：八、第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；第二，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度；第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱第一、二點是完全分離的必要條件。作為一個色譜理論，它不 僅應說明組分在色譜柱中移動的速率，而且應說明組分在移動過程中 引起區(qū)域擴寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過程中

20、分配 系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。（二）塔板理論把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組 分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指 標 ，即 色 譜 柱 是 由 一 系 列 連 續(xù) 的 、相 等 的 水 平 塔 板 組 成 。每 一 塊 塔 板 的 高 度 用 H 表 示 ， 稱為 塔 板 高度 ， 簡 稱 板 高 。塔板理論假設：1. 在 柱 內(nèi) 一 小 段 長 度 H 內(nèi) ， 組 分 可 以 在 兩 相 間 迅 速 達 到 平 衡 。 這 一 小 段 柱 長 稱 為 理 論 塔 板 高 度 H。2. 以 氣 相 色 譜 為 例 ，載 氣 進 入 色

21、譜 柱 不 是 連 續(xù) 進 行 的 ，而 是 脈 動 式 ， 每次進氣為一個塔板體積（A Vm）。3. 所 有 組 分 開 始 時 存 在 于 第 0 號 塔 板 上， 而 且 試 樣 沿 軸（ 縱 ） 向 擴 散可忽略。4. 分 配 系 數(shù) 在 所 有 塔 板 上 是 常 數(shù) ， 與 組 分 在 某 一 塔 板 上 的 量 無 關 。簡 單 地 認 為 ：在 每 一 塊 塔 板 上 ，溶 質(zhì) 在兩 相 間 很 快 達 到 分 配 平 衡 ，然 后 隨 著 流 動 相 按 一 個 一 個 塔 板 的 方 式 向 前 移 動 。對 于 一 根 長 為 L 的 色 譜 柱 ，溶 質(zhì) 平 衡 的 次

22、 數(shù) 應為 ：n = L / Hn 稱 為 理 論 塔 板 數(shù) 。 與 精 餾 塔一 樣 ，色譜 柱 的 柱 效 隨 理 論 塔 板 數(shù) n 的 增 加 而 增 加 ，隨 板 高 H 的 增 大 而減 小 。塔板理論指出：第 一 ， 當 溶 質(zhì) 在 柱 中 的平 衡 次 數(shù) ， 即 理論 塔 板 數(shù) n 大 于 50 時 ，可 得 到 基 本 對 稱的 峰 形 曲線 。 在 色 譜 柱 中 ，n 值一 般 很 大 ，如 氣 相 色 譜 柱的 n 約 為 10 3 106 ， 因 而 這 時 的 流出 曲 線 可 趨 近 于 正 態(tài) 分 布曲線。第二，當樣品進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配

23、 系 數(shù) 有 微 小 差 異 ，經(jīng) 過反 復 多 次 的 分 配 平衡 后 ，仍 可獲 得 良 好 的 分 離 。第三，n與半峰寬及峰底寬的關系式為：n = 5. 54( t r / Wi/2)2 =16( t r / W)2式中t r與W/ 2( W )應采用同一單位(時間或距離)。從公式可以看出，在t r 一定時，如果色譜峰很窄，則說明n越大，H越小， 柱效能越高。在實際工作中，由公式 n = L / H和 n = 5.54(t r / W 1/2) 2=1 6 ( t r / W) 2計算出來的的n和H值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因 為采用t r計算時，沒有扣除死時間t m，

24、 所以常用有效塔板數(shù)n有效 表示柱效：n 有效=5.54 (t r / Wi/2)2 = 16( t r / W)2有效板咼 ：H有效=L / n有效因為在相同的色譜條件下，對不同的物質(zhì)計算的塔板數(shù)不一樣， 因此，在說明柱效時，除注明色譜條件外，還應指出用什么物質(zhì)進行 測量。例 已知某組分峰的峰底寬為40 s ,保留時間為400 s ，計算此 色譜柱的理論塔板數(shù)。解： n =1 6 ( t r / W ) 2= 1 6( 40 0 /4 0) 2= 1 600 塊塔板理論是一種半經(jīng)驗性理論。它用熱力學的觀點定量說明了 溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計算 和評價柱效高低

25、的參數(shù)。但是，色譜過程不僅受熱力學因素的影響， 而且還與分子的擴散、傳質(zhì)等動力學因素有關，因此塔板理論只能定 性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明 為 什 么 在 不 同 的 流 速下 ，可 以測 得 不 同 的 理 論 塔 板 數(shù) ，因 而 限 制 了 它 的應用。（三）速率理論19 56 年 荷 蘭 學 者 va n D ee mte r （ 范 第 姆 特 ） 等 在 研 究 氣 液 色 譜 時 ，提 出 了 色 譜 過 程 動 力 學 理 論 速 率 理 論 。他 們 吸 收 了 塔 板 理 論 中 板 高 的 概 念 ，并 充 分 考 慮 了組 分 在 兩 相

26、 間 的 擴 散 和 傳 質(zhì) 過 程 ，從 而 在 動 力 學 基 礎 上 較 好地 解 釋 了影 響 板 高 的 各 種因 素 。該 理 論 模 型 對 氣 相 、 液 相 色 譜 都 適 用。 van Dee mt er 方 程 的 數(shù) 學 簡 化 式 為H = A + B / u + C u式 中 u 為 流 動 相 的 線 速 度 ； A、 B、 C、 為 常 數(shù) ， 分 別 代 表 渦 流 擴 散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。第 三 節(jié)色 譜 法 基 本 原 理1. 渦 流 擴 散 項 A在 填 充 色 譜 柱 中 ，當 組 分 隨 流 動 相 向 柱 出口 遷 移 時，流

27、動 相 由 于 受 到 固 定 相 顆 粒 障礙 ，不 斷改 變 流 動 方 向 ，使 組 分 分 子 在 前 進 中 形 成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴散。由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱 中 路 徑 長 短 不 一 ， 因 而 同 時 進 色 譜 柱 的 相 同 組 分 到 達 柱 口 時 間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：A =2 入 dp上 式 表 明 ，A 與 填 充 物的 平 均 直徑 d p 的大 小 和 填 充 不 規(guī) 則 因 子 入有關，與 流動相的性質(zhì)、線 速度和組分性質(zhì)無關。為了減少渦流擴 散，提高柱效，使用細而均勻

28、的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。 對 于 空 心 毛 細 管 ， 不存 在 渦 流擴 散 。 因 此 A = 0。2. 分 子 擴 散 項 B / u ( 縱 向 擴 散 項 )縱 向 分 子 擴 散是 由 濃 度 梯 度 造 成 的 。組 分 從 柱 入 口 加入 ，其 濃 度 分 布 的 構 型 呈“ 塞 子 ”狀 。它 隨 著 流動 相 向 前 推 進 ，由 于 存 在 濃 度 梯 度 ，“ 塞 子 ” 必 然 自 發(fā) 的 向 前 和 向 后 擴 散 ， 造 成 譜 帶 展 寬 。 分 子 擴 散 項系數(shù)為 B = 2 yDgY是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它 反

29、映 了 固 定 相 顆 粒 的 幾 何 形 狀對 自 由 分 子 擴 散 的 阻 礙 情況 。Dg為組分在流動相中擴散系數(shù)(cm3 s-1),分子擴散項與組分 在 流 動 相 中 擴 散系 數(shù) Dg 成 正 比 .Dg 與 流 動 相 及 組 分 性 質(zhì) 有 關 ：( a) 相 對 分 子 質(zhì) 量 大 的 組 分 Dg 小 ， Dg 反 比 于 流 動 相 相 對 分 子 質(zhì) 量 的 平 方 根，所 以采 用相 對分子質(zhì)量 較大的流 動相，可使B 項降 低；( b) D g隨柱 溫增 高而 增加，但 反 比于柱壓 。另 外 縱 向 擴 散 與 組 分 在 色 譜 柱 內(nèi) 停 留 時 間 有 關

30、 ，流 動 相 流 速 小 ， 組 分 停留時 間長 ，縱 向擴散就 大 。因 此為 降低 縱向擴 散 影 響 ，要 加大流 動 相速度 。對 于液相色譜， 組 分在流動 相中縱 向擴散 可以 忽略。3. 傳 質(zhì) 阻 力 項 Cu由 于 氣 相 色 譜 以 氣 體 為 流 動 相 ， 液 相 色 譜 以 液 體 為 流 動 相 ， 它 們 的 傳 質(zhì) 過 程 不 完 全相 同 。1) 氣 液 色 譜傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù) Ci兩項，即C = C g + C i氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。這 一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進

31、行濃度分配。有的 分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得試 樣在兩相界面上不 能瞬間達到分 配平衡，引 起滯后現(xiàn)象，從而使色譜 峰變寬。對于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為：Cg= 0. 01 k2 / (1+ k) 2 dp /Dg式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度 dp的平方成正比，與組分在載氣流中的擴散系數(shù)Dg成反比。因此， 采用粒度小的填充物和相對分子質(zhì)量小的氣體(如氫氣)做載氣，可 使Cg減小，提高柱效。液相傳質(zhì)過程是指試樣組分從固定相的氣/液界面移動到液相 內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達到分配平衡，然后又返回氣/液界面的傳

32、質(zhì)過程。這個過程也需要一定的時間，此時，氣相中組分的其它分子 仍隨載氣不斷向柱口運動，于是造成峰形擴張。液相傳質(zhì)阻力系數(shù) Ci 為：Ci = 2 /3 k / (1 + k )2* d f2 / Di由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴散系數(shù) Di大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度， 但k值隨之變小，又會使Ci增大。當固定液含量一定時，液膜厚度 隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體 來降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分離。雖然提高柱溫可增大Di,但會使k值減小，為了保持適當?shù)腃i 值，應控制適宜的柱溫。（2

33、）液液分配色譜傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳 質(zhì)阻力系數(shù)（Cs），即Cm +其中Cm又包含流動的流動相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力，即：Cm =Dm +2s md p/ D式中右邊第一項為流動的流動相中的傳質(zhì)阻力。當流動相流過色 譜柱內(nèi)的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間的稍 慢一些，故柱內(nèi)流動相的流速是不均勻的。這種傳質(zhì)阻力對板高的影響與固定相粒度dp的平方成正比， 與試樣分子在流動相中的擴散系數(shù)Dm成反比，3 m是由柱和填充的性 質(zhì)決定的因子。右邊第二項為滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力。這是由 于固定相的多孔性，會造成某部分流動相滯留在一個局部

34、，滯留在固 定相微孔內(nèi)的流動相一般是停滯不動的流動相中的試樣分子要與固 定相進行質(zhì)量交換，必須首先擴散到滯留區(qū)。如果固定相的微孔既小 又深，傳質(zhì)速率就慢，對峰的擴展影響就大（如教材P. 302圖15.6 所示）。式中3 m是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的 分數(shù)及容量因子有關。顯然，固定相的粒度愈小，微孔孔徑愈大，傳 質(zhì)速率就愈快，柱效就高。對高效液相色譜固定相的設計就是基于這液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs）可用下式表示：2Cs=. s df / Ds公式說明試樣分子從流動相進入固定液內(nèi)進行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過程 與液膜厚度df平方成正比，與試樣分子在固定液的擴散系數(shù)Ds成反 比。式

35、中3 s是與容量因子k有關的系數(shù)。氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主要 區(qū)別在液液色譜中縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的主要因素是傳 質(zhì)阻力項。4. 流動相線速度對板高的影響(1 ) LC 和 GC 的 H-u 圖根據(jù)va n Dee mt er公式作LC和 GC的 H-u圖，LC和 GC的 H- u圖十分相似，對應某一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是 柱效最高點；LC板高極小值比GC的極小值小一個數(shù)量級以上，說明 液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；LC的板高最低點相應流速比起 GC的流速亦小一個數(shù)量級，說明對于LC,為了取得良好的柱效，流 速不一定要很高。(2 )分子

36、擴散項和傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻較低線速時，分子擴散項起主要作用；較高線速時，傳質(zhì)阻 力項起主要作用；其中流動相傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻幾乎是一個定 值。在高線速度時，固定相傳質(zhì)阻力項成為影響板高的主要因素，隨 著速度增高，板高值越來越大，柱效急劇下降。5. 固定相粒度大小對板高的影響粒度越細，板高越小，并且受線速度影響亦小 這就是為什么在HPLC中采用細顆粒作固定相的根據(jù)。當然，固定相 顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術，流動相流速才能符合實 驗要求。第四節(jié)分離度分離度R是一個綜合性指標。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效 能指標。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜

37、峰保留值之差 與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即R =2 （t r 2 - t rl）/ W 1 +W2R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當R<1時，兩 峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達98% ；當R=1.5時，分離程 度可達99.7 %0通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。第五節(jié) 基本色譜分離方程式分離度受柱效（n ）、選擇因子（a）和容量因子(k)三個參數(shù)的控制。對于難分離物質(zhì)對，由于它們的分配系數(shù)差別小，可合理地假設 k 1k2=k , WW2 =Wo由n =1 6( t r/W2得：1/ W=(n /4)(1 /t r )分離度R為：R =(n /4

38、)* (a- 1/a)(k /1+ k) - ( 1 )上式即為基本色譜分離方程式在實際應用中，往往用neff代替n 。2 n =( 1 + k/k)neff基本的色譜方程的表達式：R =(盜 n ef f /4)* ( a - 1/ a )-(2 )1. 分離度與柱效的關系由公式(2 )可以看出，具有一定相對保留值a的物質(zhì)對，分離度直接和有效塔板數(shù)有關，說明有效塔板數(shù)能正確地代表柱效能。由公式(1 )說明分離度與理論塔板數(shù)的關系還受熱力學性質(zhì)的影響。當固定相確定，被分離物質(zhì)對的a確定后，分離度將取決于n<這時，對于一定理論板高的柱子，分離度的平方與柱長成正比，即2(R1 /R2)= n

39、 / n 2 = L1 / L 2說明用柱長的色譜柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因 此，提 高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板 高，以提高分離度。2. 分離度與選擇因子的關系由基本色譜方程式判斷，當 a = 1時，R = 0。這時，無論怎樣 提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，a大，選擇性好。研究證明a 的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固定相和流 動相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可有效增大a值3. 分離度與容量因子的關系如果設 Q=( n /4)( a - 1/ a )，那么：R = Q ( k /1 + k )當k>10時，隨容量因子增大，分離度的

40、增長是微乎其微的。一般取k為2 10最宜。對于GC,通過提高溫度，可選擇合適的k值， 以改進分離度。而對于LC,只要改變流動相的組成，就能有效地控 制k值。它對LC的分離能起到立竿見影的效果。4. 分離度與分析時間的關系當k在25時，可在較短的分析時間，取得良好的分離度。第六節(jié) 色譜定性和定量分析一、色譜的定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種 物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種 定性指標。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質(zhì) 在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專 屬的。因此僅根據(jù)保留值對一個完全未知的樣品

41、定性是困難的。如果 在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎上，對樣品組成作初步的 判斷，再結合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。(一) 利用純物質(zhì)對照定性在一定的色譜條件下，一個未知物只有一個確定的保留時間。 因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時間與未知物的保留 時間進行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能 是已知的純物質(zhì)；不 同，則未知物就不是該純物質(zhì)。純物質(zhì)對照法定 性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡單，且有純物質(zhì)的未知 物。（二）相對保留值法相對保留值a is是指組分i與基準物質(zhì)S調(diào)整保留值的比值a is = t ri / t rs '= Vr

42、i / Vr s它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關。相對保留值測定方法：在某一固定相及柱溫下，分別測出組分 i和基準物質(zhì)s的調(diào)整保留值，再按上式計算即可。用已求出的相對保留值與文獻相應值比較即可定性。通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質(zhì)作基準 物質(zhì)，如正丁烷、環(huán)己烷、正戊烷、苯、對二甲苯、環(huán)己醇、環(huán)己酮 等。（三）加入已知物增加峰高法當未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨 認時，或僅作未知樣品指定項目分析時均可用此法。首先作出未知樣 品的色譜圖，然后在未知樣品加入某已知物，又得到一個色譜圖。峰 高增加的組分即可能為這種已知物。第六節(jié) 色譜定性和定量分析

43、（四）保留指數(shù)定性法保留指數(shù)又稱為柯瓦(Kov at s )指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上 的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認的定性指標。它具有 重現(xiàn)性好、標準統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點。保留指數(shù)也是一種相對保留值，它是把正構烷烴中某兩個組分 的調(diào)整保留值的對數(shù)作為相對的尺度，并假定正構烷烴的保留指數(shù)為 n 10 0。被測物的保留指數(shù)值可用內(nèi)插法計算。例如，若確定物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數(shù)I 1 x的數(shù)值。 先選取兩個正構烷烴作為基準物質(zhì)，其中一個的碳數(shù)為Z，另一個為 Z+1 ，它們的調(diào)整保留時間分別為t R(Z)和t R( Z + 1 )，使被測物質(zhì)i 的調(diào)整保留時間t R( i )恰好

44、于兩者之間，即t R( Z) : t R ( i ): t R( Z+ 1 )0將含物質(zhì)i和所選的兩個正構烷烴的混合物注入其固定液X的色譜 柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。大量實驗數(shù)據(jù)表明，化合物調(diào)整 保留時間的對數(shù)值與其保留指數(shù)間的關系基本上是一條直線關系。據(jù) 此，可用內(nèi)插法求算X 0I x = 100 Z + ( Igt R(i)- lg t r(z) /( lg t R(z+i)-lg t r(z)保留指數(shù)的物理意義在于：它是與被測物質(zhì)具有相同調(diào)整保留 時間的假想的正構烷烴的碳數(shù)乘以100 o保留指數(shù)僅與固定相的性 質(zhì)、柱溫有關，與其它實驗條件無關。其準確度和重現(xiàn)性都很好。只 要柱溫與固

45、定相相同，就可應用文獻值進行鑒定，而不必用純物質(zhì)相 對照。(五) 其它方法二、定量分析定量分析的任務是求出混合樣品中各組分的百分含量。色譜定 量的依據(jù)是，當操作條件一致時，被測組分的質(zhì)量(或濃度)與檢測 器給出的響應信號成正比。即 :- i = f i Ai式中 '為被測組分i的質(zhì)量；Ai為被測組分i的峰面積；f 為被測組分i的校正因子。可見，進行色譜定量分析時需要：（1）準確測量檢測器的響應信號一峰面積或峰高；（2）準確求得比例常數(shù)一校正因子；（3）正確選擇合適的定量計算方法，將測得的峰面積或 峰高換算 為組分的百分含量。（一）峰面積測量方法峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測

46、量的準確與否 直接影響定量結果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的測量方法。（1）對稱形峰面積的測量一一峰高乘以半峰寬法對稱峰的面積 A = 1. 06 5 h W/2（2）不對稱形峰面積的測量一一峰高乘平均峰寬法對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因 此采用峰高乘平均峰寬法。A = 1/ 2* h（ W0. 15 + Wo.85）式中W0. 15和W0.85分別為峰高0.15 倍和0. 85倍處的峰寬。（二）定量校正因子色譜定量分析的依據(jù)是被測組分的量與其峰面積成正比。但是 峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關。即當 兩個質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢

47、測器進行測定時， 所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分含量并不等 于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率。這樣，就不 能直接利用峰面積計算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實反映出物質(zhì) 的質(zhì)量，就要對峰面積進行校正，即在定量計算是引入校正因子。校正因子分為絕對校正因子和相對校正因子。f i = m / Ai式中f i值與組分i質(zhì)量絕對值成正比，所以稱為絕對校正因子。 在定量分析時要精確求出fi值是比較困難的。一方面由于精確測量 絕對進樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關，要保持測定fi 值時的色譜條件相同，既不可能又不方便。另外即便能夠得到準確的 fi值，也由于沒有統(tǒng)一的標

48、準而無法直接應用。為此提出相對校正因 子的概念來解決色譜定量分析中的計算問題。1. 相對校正因子相對校正因子定義為f i= f i / f s即某組分i的相對校正因子f為組分i與標準物質(zhì)s的絕對校 正因子之比。f i =（ m/Ai）/ （ ms/As） = （ m / m s）* （ As / A、）可見，相對校正因子f i就是當組分i的質(zhì)量與標準物質(zhì)s相等時， 標準物質(zhì)的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。若某組分質(zhì)量為m ,峰 面積Ai，則fJ Ai的數(shù)值與質(zhì)量為m的標準物質(zhì)的峰面積相等。也就是說，通過相對校正因子，可以把各個組分的峰面積分別換算成與 其質(zhì)量相等的標準物質(zhì)的峰面積，于是比較標準就

49、統(tǒng)一了。這就是歸 一法求算各組分百分含量的基礎。2. 相對校正因子的表示方法上面介紹的相對校正因子中組分和標準物質(zhì)都是以質(zhì)量表示 的，故又稱為相對質(zhì)量校正因子；若以摩爾為單位，相對摩爾校正因 子；另外相對校正因子的倒數(shù)還可定義為相對響應值S'(分別為相對 質(zhì)量響應值Sw 相對摩爾響應值Sn )。通常所指的校正因子都是相 對校正因子。3. 相對校正因子的測定方法相對校正因子值只與被測物和標準物以及檢測器的類型有關， 而與操作條件無關。因此，f值可自文獻中查出引用。若文獻中 查不到所需的f值，也可以自己測定。常用的標準物質(zhì)，對熱導檢 測器(TCD)是苯，對氫焰檢測器(FI D)是正庚烷。測定相對校正因子最好是用色譜純試劑。若無純品，也要確知 該物質(zhì)的百分含量。測定時首