分子生物學牛人筆記

1、分子生物學牛人筆記二、現(xiàn)代分子生物學中的主要里程碑 分子生物學是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構特征及其重要性、規(guī)律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物 世界的奧秘，由被動地適應自然界轉(zhuǎn)向主動地改造和重組自然界的根底學科。當人們意識到同一生物不同世代之間的連續(xù)性是由生物體自身所攜 帶的遺傳物質(zhì)所決定的，科學家為揭示這些遺傳密碼所進行的努力就成為人類征服自然的一局部，而以生物大分子為研究對像的分子生物學就迅 速成為現(xiàn)代社會中最具活力的科學。從 1847 年 Schleiden 和 Schwann 提出 " 細胞學說 " ，證明動、植物都是由細胞組成的

2、到今天，雖然不過短短一百多年時間，我們對生物大分子-細胞的化學組成卻有了深刻的認識。孟德爾的遺傳學規(guī)律最先使人們對性狀遺傳產(chǎn)生了理性認識，而Morgan的基因?qū)W說那么進一步將性狀"與"基因"相耦聯(lián)，成為分子遺傳學的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。在蛋白質(zhì)化學方面，繼Sumner在1936年證實酶是蛋白質(zhì)之后，Sanger利用紙電泳及層析技術于1953年首次說明胰島素的一級結(jié)構，開創(chuàng)了蛋白質(zhì)序列分析的先河。而 Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術解析了肌紅蛋白 myoglobin 及血紅

3、蛋白hemoglobin 的三維結(jié)構，論證了這些蛋 白質(zhì)在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構型的先驅(qū)。1910 年，德國科學家 Kossel 第一個別離了腺嘌呤，胸腺嘧啶和組氨酸。1959年，美國科學家 Uchoa第一次合成了核糖核酸，實現(xiàn)了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。同年， Kornberg實現(xiàn)了試管內(nèi)細菌細胞中DNA的復制。1962年，Watson 美和Crick 英因為在1953年提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫(yī)學獎，后者通過 X射線衍射證實了 Watson-Crick 模型。1965年，法國科學家Jacob和

4、Monod提出并證實了操縱子operon 作為調(diào)節(jié)細菌細胞代謝的分子機制。此外，他們還首次推測存在一種與DNA序列相互補、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場所細胞質(zhì)并翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRN信使核糖核酸。1972 年，Paul Berg 美第一次進行了 DNA重組。1977年，Sanger和Gilbert 英第一次進行了 DNA序列分析。1988年， McClintock 由于在 50年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動遺傳因子 jumping gene 或稱 mobile element 而獲得 Nobel 獎。1993年，美國科學家 Roberts和Sharp因發(fā)現(xiàn)斷裂基因introns 而獲得Nob

5、el獎。Mullis由于創(chuàng)造PCR儀而與加拿大學者 Smith 第一個設 計基因定點突變共享 Nobel 化學獎。此外，Griffith1928及Avery 1944等人關于致病力強的光滑型S型肺炎鏈球菌 DNA導致致病力弱的粗糙型R型細菌發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化的實驗；Hershey和Chase 1952關于DNA是遺傳物質(zhì)的實驗；Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律即中心法那么:Meselson和Stahl1958關于DNA半保存復制的實驗以及 Yanofsky和Brener 1961 年關于遺傳密碼三聯(lián)子的設想都為分子生物學的開展做出了重大奉獻。 我國生物科學家吳憲 20世紀 20年代初回

6、國后在協(xié)和醫(yī)科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測和免疫化學 等一系列有重大影響的研究，成為我國生物化學界的先驅(qū)。 20 世紀 60 年代、 70年代和 80 年代，我國科學家相繼實現(xiàn)了人工全合成有生物學活 性的結(jié)晶牛胰島素，解出了三方二鋅豬胰島素的晶體結(jié)構，采用有機合成與酶促相結(jié)合的方法完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成，在 酶學研究、蛋白質(zhì)結(jié)構及生物膜結(jié)構與功能等方面都有世所矚目的建樹。三、分子生物學的主要研究內(nèi)容 所有生物體中的有機大分子都是以碳原子為核心，并以共價鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構成的。不僅如此，一切生物體中的各類有機 大分子都是由

7、完全相同的單體，如蛋白質(zhì)分子中的20種氨基酸、DNA及 RNA中的8種堿基所組合而成的，由此產(chǎn)生了分子生物學的3條根本原理：1 構成生物體有機大分子的單體在不同生物中都是相同的；2 生物體內(nèi)一切有機大分子的建成都遵循著各自特定的規(guī)那么；3 某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了它的屬性。分子生物學研究內(nèi)容 :DNA重組技術-基因工程基因表達調(diào)控核酸生物學生物大分子結(jié)構功能-結(jié)構分子生物學DNA重組技術又稱基因工程：這是20世紀70年代初興起的技術科學，目的是將不同DNA片段如某個基因或基因的一局部按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生影響受體細胞的新

8、的遺傳性狀。嚴格地說，DNA重組技術并不完全等于基因工程，因為后者還包括其他可能使生物細胞基因組結(jié)構得到改造的體系。DNA重組技術是核酸化學、蛋白質(zhì)化學、酶工程及微生物學、遺傳學、細胞學長期深入研究的結(jié)晶，而限制性內(nèi)切酶DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)與應用那么是這一技術得以建立的關鍵。DNA重組技術有著廣闊的應用前景：DNA重組技術可用于定向改造某些生物基因組結(jié)構，使它們所具備的特殊經(jīng)濟價值或功能得以成百上千倍的地提高。DNA重組技術還被用來進行根底研究。如果說，分子生物學研究的核心是遺傳信息的傳遞和控制，那么根據(jù)中心法那么，我們要研究的就 是從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的全過程，也即基因的表達

9、與調(diào)控。在這里，無論是對啟動子的研究包括調(diào)控元件或稱順式作用元件，還是對轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分析，都離不開重組DNA技術的應用?；虮磉_調(diào)控研究： 因為蛋白質(zhì)分子參與并控制了細胞的一切代謝活動， 而決定蛋白質(zhì)結(jié)構和合成時序的信息都由核酸 主要是脫氧核糖核酸 分子編碼，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列，所以基因表達實質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個體生長發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達按一定的時 序發(fā)生變化時序調(diào)節(jié) ，并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正環(huán)境調(diào)控 。原核生物的基因組和染色體結(jié)構都比真核生物簡單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物有細 胞核結(jié)構，轉(zhuǎn)錄和翻譯過

10、程在時間和空間上都被分隔開，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復雜的信息加工過程，其基因表達的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同的 水平上?；虮磉_調(diào)控主要表現(xiàn)在信號傳導研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及RNA剪輯3個方面。轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因 5'端上游特定序列專一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。真核基因在結(jié)構上的不連續(xù)性是近10年來生物學上的重大發(fā)現(xiàn)之一。當基因轉(zhuǎn)錄成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚 ApolyA之外，還要將隔開各個相鄰編碼區(qū)的內(nèi)含子剪去，使外顯子編碼區(qū)相連后成為成熟mRNA研究發(fā)現(xiàn)，有許多基因不是將它們的內(nèi)含子全部剪去，而是在不同

11、的細胞或不同的發(fā)育階段有選擇地剪接其中局部內(nèi)含子，因此生成不同的mRNA蛋白質(zhì)分子。結(jié)構分子生物學： 生物大分子的結(jié)構功能研究又稱結(jié)構分子生物學一個生物大分子，無論是核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學功能時，必須具備兩個前提 : 首先，它擁有特定的空間結(jié)構三維結(jié)構 ；其次，在它發(fā)揮生物學功能的過程中必定存在著結(jié)構和構象的變化。 結(jié)構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構及結(jié)構的運動變化與其生物學功能關系的科學。它包括結(jié)構的測定、結(jié)構運動變化規(guī)律的探 索及結(jié)構與功能相互關系的建立 3 個主要研究方向。最常見的研究三維結(jié)構及其運動規(guī)律的手段是X 射線衍射的晶體學又稱蛋白質(zhì)晶體學 ，其次是用二維核

12、磁共振和多維核磁研究液相結(jié)構，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學方法研究生物高分子的空間結(jié)構。第二講 染色體與 DNA一、DNA的組成與結(jié)構Avery 在 1944 年的研究報告中寫道： "當溶液中酒精的體積到達 9/10 時，有纖維狀物質(zhì)析出。如稍加攪拌，它就會象棉線在線軸上一樣繞在硬棒 上，溶液中的其它成份那么呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質(zhì)并重復數(shù)次，可提高其純度。這一物質(zhì)具有很強的生物學活性，初步實驗證實，它很可 能就是DNA誰能想到！"。對DNA分子的物理化學研究導致了現(xiàn)代生物學翻天覆地的革命，這更是 Avery所沒有想到。所謂DNA的級結(jié)構，就是指

13、 4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對 DNA高級結(jié)構的形成有很大影響，如B-DNA中多聚G-C區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋 DNAZ-DNA，而反向重復的DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構等。 DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特 殊的高級結(jié)構，它主要以有規(guī)那么的雙螺旋形式存在，其根本特點是：1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構成根本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。3、 兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌吟與嘧啶配對，而且腺嘌吟A只能與胸腺嘧啶T配對，鳥嘌吟G只能與胞嘧啶

14、C配對。如一條鏈上某一堿基是C,另一條鏈上與它配對的堿基必定是G堿基之間的這種一一對應的關系叫堿基互補配對原那么。組成DNA分子的堿基雖然只有 4種，它們的配對方式也只有A與T, C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構成了 DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。二、DNA聚合酶與DNA的合成The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing. The actual rate in bacteria seems to be -1

15、0-8-10-10. Thiscorresponds to -1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or -10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either or both of two stages:1 ， It could scrutinize the incoming base for the proper complementar

16、ity with the template base; for example, by specificallyrecongnizing matching chemical features. This would be a presynthetic error control.2， Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistakehas been made, remove the most rec

17、ently added base. This would be a proofreading control.三、DNA勺生理意義及成分分析早在 1928年英國科學家 Griffith 等人就發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細菌的毒性致病力是由細胞外表莢膜中的多糖所決 定的。具有光滑外表的 S型肺炎鏈球菌因為帶有莢膜多糖而都能使小鼠發(fā)病，而具有粗糙外表的R型因為沒有莢膜多糖而失去致病力莢膜多糖能保護細菌免受運動白細胞攻擊 。首先用實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學家Avery。Avery等人將光滑型致病菌S型燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細菌自然喪失了致病能力。

18、再用活的粗糙型細菌 R 型來侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因為粗糙型細菌天然無致病力。當他們將經(jīng)燒煮殺 死的S型細菌和活的R型細菌混合再感染小鼠時，實驗小鼠每次都死了。解剖死鼠，發(fā)現(xiàn)有大量活的S型而不是R型細菌。他們推測，死細菌中的某一成分棗轉(zhuǎn)化源 transforming principle 將無致病力的細菌轉(zhuǎn)化成病原細菌。美國冷泉港卡內(nèi)基遺傳學實驗室科學家Hershey和他的學生Chase在1952年從事噬菌體侵染細菌的實驗。噬菌體專門寄生在細菌體內(nèi)。它的頭、尾外部都有由蛋白質(zhì)組成的外殼，頭內(nèi)主要是DNA噬菌體侵染細菌的過程可以分為以下5個步驟：噬菌體用尾部的末端基片、尾絲吸附在細菌外表；噬菌

19、體通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內(nèi)，噬菌體的蛋白質(zhì)外殼那么留在細胞外面；噬菌體的DNA一旦進入細菌體內(nèi)，它就能利用細菌的生命過程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質(zhì)；新合成的DNA和蛋白質(zhì)外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；子代噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細菌。他們發(fā)現(xiàn)被感染的細菌中帶有70%勺噬菌體DNA但只帶有20%勺噬菌體蛋白質(zhì)。子代噬菌體中帶有50%標記的DNA卻只有1%勺標記蛋白質(zhì)。四、C-value 和 Cot1/2The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of ea

20、ch living species known as C-value.x second/liter.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles五、染色體結(jié)構DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called“ chromosomes, mostbacteria &

21、viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一條染色體上都帶有許多基因， 一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬個基因， 一個細胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為 genomes 基因組。如果設想將人體細胞中的 DNA分子繞地球一周，那么，每個堿基大約只占1 - 5厘米，而一個2-3kb的基因只相當于地球上一條數(shù)十米長，數(shù)厘米寬的線段！Genotype 基因型： The genetic constitution of a given organism 指某個特定生物體細胞內(nèi)

22、的全部遺傳物質(zhì) 。Phenotype 表現(xiàn)型 ： Visible property of any given organism 某個特定生物體中可觀察到的物理或生理現(xiàn)象 。Mutations : 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。六、染色體的組成1 染色質(zhì)和核小體染色質(zhì)DNA的 Tm值比自由DNA高，說明在染色質(zhì)中DNA極可能與蛋白質(zhì)分子相互作用；在染色質(zhì)狀態(tài)下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復制和轉(zhuǎn)錄活性大大低于在自由DNA中的反響；DNA酶I DNaseI對染色質(zhì)DNA的消化遠遠慢于對純 DNA的作用。染色質(zhì)的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結(jié)構，可以看到由一條細絲連接

23、著的一連串直徑為10nm的球狀體。核小體是由H2A H2B H3 H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1那么在核小體的外面。每個核小體只有一個 H1。在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長度約為68nm卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色體中含3.3 x 109堿基對，其理論長度應是 180cm,這么長的DNA被包含在46個51卩m長的圓柱體染色體中，其壓縮比約為104。2染色體中的核酸組成不重復序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%-80%

24、不重復序列長約 750- 2000dp，相當于一個結(jié)構基因的長度。單拷貝基因通過基因擴增仍可合成大量的蛋白質(zhì)，如一個蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個絲心蛋白mRNA每個mRNA可存活4d，共合成105個絲心蛋白，這樣，在幾天之內(nèi)，一個單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個絲心蛋白分子 。中度重復序列 這類重復序列的重復次數(shù)在10- 104之間，占總DNA的 10滄40%各種rRNA tRNA及組蛋白基因等都屬這一類。非洲爪蟾的18S 5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，這些單位在DNA鏈上串聯(lián)重復約5000次。在卵細胞形成過程中這些基因可進行幾千次不同比例的復制

25、，產(chǎn)生2X 106個拷貝，使rDNA占卵細胞DNA的 75%,從而使該細胞能積累 1012個核糖體。高度重復序列一一衛(wèi)星 DNA這類DNAM在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%-60%,由6100個堿基組成，在 DNA鏈上串聯(lián)重復幾百萬次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他 DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶峰。高等真核生物DNA無論從結(jié)構還是功能看都極為復雜，以小鼠為例：1. 小鼠總DNA的10%是小于10bp的高度重復序列，重復數(shù)十萬到上百萬次/genome。2. 總DNA的 20%是重復數(shù)千次、長約數(shù)百bp的中等重復序列。3. 總DNA勺7

26、0%是不重復或低重復序列，絕大局部功能基因都位于這類序列中。Centromere ：是細胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質(zhì)與染色體的結(jié)合位點 attachment point ，這種結(jié)合對于染色體對在子細胞中的有序和平均分 配至關重要。在酵母中， centromere 的功能單位長約 130 bp ，富含 AT 堿基對。在高等真核細胞中， centromere 都是由長約 5- 10 bp 、方向相 同的高度重復序列所組成。5'TxGyn3' AxCyn其中X Y一般為1 4,單細胞真核生物中 n常為20 100,高等真核生物中1500。Alu 長約300bp是人類高度重復序列，因為該

27、序列中帶有 AluI的識別序列而得名。數(shù)十萬個Alu重復序列散布于整個人類基因組中，到達總序列的1-3%。Alu與其它高度重復序列共占人類DNA的 10%以上。3染色體中的蛋白質(zhì)染色體上的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。 組蛋白是染色體的結(jié)構蛋白， 它與DNA組成核小體。通?？梢杂?mol/L NaCl或0.25mol/L的HCI/H2SO4 處理使組蛋白與 DNA分開。組蛋白分為 H1、H2A H2B H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨酸和精氨酸，其中H3 H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A H2B介于兩者之間。組蛋白的一般特性進化上的極端保守性。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛

28、的H4序列與豌豆序列相比只有兩個氨基酸的差異豌豆 H4中的異亮氨基酸60-纈氨酸60,精氨酸-賴氨酸。H3的保守性也很大，鯉魚與小牛胸腺的H3只差一個氨基酸，小牛胸腺與豌豆H3只差4個氨基酸。無組織特異性。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5,精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。肽鏈上氨基酸分布的不對稱性。堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。例如，N端的半條鏈上凈電荷為+16, C端只有+3,大局部疏水基團都分布在 C 端。組蛋白的修飾作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。非組蛋白的一般特性染色體上除了存在大約與DNA等量的組蛋白以外，還存在大量的非組蛋

29、白。非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%-70%,但它的種類卻很多，約在 20-100 種之間，其中常見的有 15-20 種。 非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。(3) 幾類常見的非組蛋白a. HMG蛋白(high mobility group protein )。這是一類能用低鹽(0.35mol/L NaCI )溶液抽提、能溶于 2%勺三氯乙酸、相對分子質(zhì)量較低的非組蛋白，相對分子質(zhì)量都在3.0 X 104以下。b. DNA結(jié)合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部組蛋白和 70%非組蛋白后，還有一局部蛋白必須用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白

30、分子量較低，約占非組蛋白的20%，染色質(zhì)的 8%。七. 原核與真核染色體 DNA:匕較原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因如rRNA基因是以多拷貝形式存在；整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成； 幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對應狀態(tài)。Viral DNA molecules are relatively smallHIV = 9000 nt RNAQB = 4200 ntBactaria DNA is 100 times > than viralE. coli 4639221 bp double-strandedContour l

31、ength = 1.7mm, 850 倍細菌本身長度。細菌中常常帶有質(zhì)粒DNA。Eucaryotic cells果蠅帶有25倍于E. Coli 的DNA人類帶有600倍于E. Coli 的DNA. Eucaryotic DNA 中基因密度明顯低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只帶有50個基因，而E. Coli中基因密度每毫米 DNA帶有2400個基因！ 一個人細胞中所帶有的 DNA約有2m/1.7mm細菌。成人帶有1X10T4個 細胞，成人體內(nèi)全部 DNA的總長度(Contour Length )= 2X10A11Km第三講 蛋白質(zhì)合成一. 基因與基因表達的一般概念基因作為唯一能夠自主復制

32、、永久存在的單位，其生理學功能以蛋白質(zhì)形式得到表達。DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成 mRN，A 翻譯生成蛋白質(zhì)的過程控制所有生命現(xiàn)象。編碼鏈(coding strand )又稱sense strand ，是指與 mRNA序列相同的那條鏈。非編碼鏈( anticoding strand )，又稱antisense strand ，是 指那條根據(jù)堿基互補原那么指導mRNAfe物合成的DNA鏈。Genetic information is perpetuated by replication(復制) in which a double- stranded nuc

33、leic acid is duplicated to give identicalcopies.基因表達包括轉(zhuǎn)錄(transcription )和翻譯(translation)兩個階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(除了 U之外)的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U C、A G這4種核苷酸而不是T、C A G的組合來表示遺傳性狀。所謂翻譯是指將 mRNA!上的核苷酸從一個特定的起始位點開始

34、，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原那么，依次合成一條多肽鏈的過程。二 . 遺傳密碼三聯(lián)子mRNAt每3個核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸，這3個核苷酸就稱為一個密碼，也叫三聯(lián)子密碼。翻譯時從起始密碼子AUG開始，沿mRNA' - 3'的方向連續(xù)閱讀直到終止密碼子，生成一條具有特定序列的多肽鏈。mRNA中只有4種核苷酸，而蛋白質(zhì)中有20種氨基酸，假設以一種核苷酸代表一種氨基酸，只能代表4種(41=4)。假設以兩種核苷酸作為一個密碼(二聯(lián)子)，能代表 42=16種氨基酸。而假定以 3 個核苷酸代表一個氨基酸，那么可以有 43=64種密碼，滿足了編碼 20種氨基酸的需要。50-

35、60 年代破譯遺傳密碼方面的三項重要成果：(1) Paul Zamecnik 等人證實細胞中蛋白質(zhì)合成的場所。他們把放射性標記的氨基酸注射到大鼠體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后收獲其肝臟，進行蔗糖梯 度沉淀并分析各種細胞成份中的放射性蛋白質(zhì)。如果注射后經(jīng)數(shù)小時(或數(shù)天)收獲肝臟，所有細胞成份中都帶有放射性標記的蛋白質(zhì);如果注射后幾分鐘內(nèi)即收獲肝臟，那么，放射性標記只存在于含有核糖體顆粒的細胞質(zhì)成份中。(2) Francis Crick等人第一次證實只有用三聯(lián)子密碼的形式才能把包含在由AUGC四個字母組成遺傳信息(核酸)準確無誤地翻譯成由20種不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列，實現(xiàn)遺傳信息的表達。實驗1:用吖啶類

36、試劑(誘導核苷酸插入或喪失)處理 T4噬菌體rII位點上的兩個基因，使之發(fā)生移碼突變(frame-shift )，就生成完全不同的、 沒有功能的蛋白質(zhì)。實驗2:研究煙草壞死衛(wèi)星病毒發(fā)現(xiàn)，其外殼蛋白亞基由400個氨基酸組成，相應的 RNA片段長1200個核苷酸，與密碼三聯(lián)子體系正好相吻合。實驗3:以均聚物為模板指導多肽的合成。在含有tRNA、核糖體、AA-tRNA合成酶及其它蛋白質(zhì)因子的細胞抽提物中參加mRN威人工合成的均聚物作為模板以及 ATP GTR氨基酸等成分時又能合成新的肽鏈，新生肽鏈的氨基酸順序由外加的模板來決定。1961年，Nirenberg等以poly ( U作模板時發(fā)現(xiàn)合成了多聚

37、苯丙氨酸，從而推出UUU代表苯丙氨酸(Phe)。以poly ( C)及poly ( A)做模板分別得到多聚脯氨酸和多聚賴氨酸。實驗 4: 以特定序列的共聚物為模板指導多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2 個氨基酸組成的多肽，5'UGU GUG UGU GUG UGU GUG ,不管讀碼從 U開始還是從 G開始，都只能有 UGU( Cys)及GUG(Val)兩種密碼子。實驗5:以共聚三核苷酸作為模板可得到有3種氨基酸組成的多肽。如以多聚(UUC為模板，可能有3種起讀方式：5'UUC UUC UUC UUC UUC3' 或 5 'UCU UCU UCU UCU

38、 UCU3'或 5 'CUU CUU CUU CUU CUU3'分另U產(chǎn)生 UUC( Phe)、UCU( Ser)或 CUU( Leu) .多聚三核苷酸為模板時也可能只合成2種多肽：5'GUA GUA GUA GUA GUAJ '或5'UAG UAG UAG UAG UAG3'或5'AGUAGUAGUAGUAGU-3'由第二種讀碼方式產(chǎn)生的密碼子UAG是終止密碼，不編碼任何氨基酸，因此，只產(chǎn)生GUA(Val )或AGU(Ser)。實驗6:以隨機多聚物指導多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各種隨機的多聚物作模板

39、合成多肽。例如，以只含A C的多聚核苷酸作模板，任意排列時可出現(xiàn) 8種三聯(lián)子，即 CCC CCA CAC ACG CAA ACA AAC AAA獲得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6種氨基酸組成的多 肽。( 3)氨基酸的“活化與核糖體結(jié)合技術。如果把氨基酸與 ATP和肝臟細胞質(zhì)共培養(yǎng)，氨基酸就會被固定在某些熱穩(wěn)定且可溶性RNA分子(transfer RNA tRNA) 上?，F(xiàn)將氨基酸活化后的產(chǎn)物稱為氨基酰 -tRNA (aminoacyl-tRNA )，并把催化該過程的酶稱為氨基酰合成酶( aminoacyl-tRNA Synthetase )。以人工合成的三核苷酸如 UUU

40、 UCU UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的反響液中保溫后通過硝酸纖維素濾膜，只有游離的AA-tRNA因相對分子質(zhì)量小而通過濾膜，而核糖體或與核糖體結(jié)合的AA-tRNA那么留在濾膜上，這樣可把已結(jié)合與未結(jié)合的AA-tRNA分開。當體系中帶有多聚核苷酸模板時，從大腸桿菌中提取的核糖體經(jīng)常與特異性氨基酰-tRNA相結(jié)合。如果把核糖體與poly (U)和Phe-tRNAPhe共溫育，核糖體就能同時與 poly ( U和Phe-tRNAPhe相結(jié)合。4種核苷酸組成61個編碼氨基酸的密碼子和 3個終止密碼子，它們不能與 tRNA的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鏈的合成。由一

41、種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并(degeneracy )，對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子( synonymous codon )。三密碼子和反密碼子的相互作用蛋白質(zhì)生物合成過程中，tRNA的反密碼子通過堿基的反向配對與mRNA勺密碼子相互作用。1966年，Crick根據(jù)立體化學原理提出擺動假說 (wobblehypothesis )，解釋了反密碼子中某些稀有成分如 I 以及許多有 2個以上同源密碼子的配對問題。Wobble hypothesis 任意一個密碼子的前兩位堿基都與 tRNA anticodon 中的相應堿基形成 Watson-Crick 堿基配對。 反密碼子第一

42、位是 A或C時，只能識別一個密碼子。當反密碼子第一位是U或G時，能識別兩個密碼子。當Inosine (I )作為反密碼子第一位時，能識另三個密碼子。 如果數(shù)個密碼子同時編碼一個氨基酸，但凡第一、二位堿基不相同的密碼子都對應于各自的tRNA。 根據(jù)上述規(guī)那么，至少需要 32種不同的tRNA才能翻譯61個密碼子。四 tRNAtRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關鍵地位，被稱為第二遺傳密碼。它不但為將每個三聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的 P位點和A位點結(jié)合，此時，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過密碼子：反密碼子的配對與

43、mRNA目結(jié)合，而其3'末端恰好將所轉(zhuǎn)運的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA。在一個同工tRNA組內(nèi)，所有tRNA均專一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。1. tRNA的三葉草型二級結(jié)構受體臂( acceptor arm )主要由鏈兩端序列堿基配對形成的桿狀結(jié)構和 3'端末配對的 3-4 個堿基所組成，其 3'端的最后 3 個堿基序列永遠是 CCA最后一個堿基的3'或2'自由羥基(一OH可以被氨?；?。T© C臂是根據(jù)3個核苷酸命名的，其中©表示擬尿嘧啶，是 tRNA分子所擁有 的不常見核苷酸。反密碼子臂

44、是根據(jù)位于套索中央的三聯(lián)反密碼子命名的。D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶(dihydrouracil )命名的。最常見的tRNA分子有76個堿基，相對分子質(zhì)量約為 2.5 X 104。不同的tRNA分子可有74-95個核苷酸不等，tRNA分子長度的不同主要是由其中 的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個tRNA分子至少含有2個稀有堿基，最多有19個，多數(shù)分布在非配對區(qū)，特別是在反密碼子 3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對于維持反密碼子環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對是很 重要的。2. tRNA的L形三級結(jié)構酵母和大腸桿菌tRNA的三級結(jié)

45、構都呈L形折疊式。這種結(jié)構是靠氫鍵來維持的，tRNA的三級結(jié)構與AA- tRNA合成酶的識別有關。受體臂和T©C臂的桿狀區(qū)域構成了第一個雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了第二個雙螺旋。tRNA的L形高級結(jié)構反映了其生物學功能，因為它上所運載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對，所以兩個不同的功能基團最大限度別離。3. tRNA的功能轉(zhuǎn)錄過程是信息從一種核酸分子DNA轉(zhuǎn)移至另一種結(jié)構上極為相似的核酸分子 RNA的過程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對。翻譯階段遺傳信息 從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成

46、單個氨基酸的三聯(lián)子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機制。4. tRNA的種類1起始tRNA和延伸tRNA能特異地識別mRNA!板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA,其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸fMet，真核生 物起始tRNA攜帶甲硫氨酸Met。2同工 tRNA代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA,同工tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構上的共同性，能被AA- tRNA 合成酶識別。3校正 tRNA校正tRNA分為無義突變及錯義突變校正。在蛋白質(zhì)的結(jié)構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終

47、止密碼子UAG UGA UAA，使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。五.AA- tRNA合成酶 是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反響式如下：它實際上包括兩步反響：第一步是氨基酸活化生成酶 - 氨基酰腺苷酸復合物。AA+ATP+! Et E-AA-AMP+PPi第二步是氨酰基轉(zhuǎn)移到 tRNA 3'末端腺苷殘基上，與其 2'或 3'-羥基結(jié)合。E-AA-AMP+ tRNAAA- tRNA +E+AMP蛋白質(zhì)合成的真實性主要決定于AA- tRNA合成酶是否能使氨基酸與對應的tRNA相結(jié)合。AA-tRNA合成酶既要能識別tRNA

48、,又要能識別氨基酸，它對兩者都具有高度的專一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結(jié)構，容易被tRNA合成酶所識別，困難的是這些酶如何識別結(jié)構上非常相似的氨基酸。有兩道關口 : The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the e

49、nzyme.核糖體像一個能沿 mRNA模板移動的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。它是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNAribosomal RNA，rRNA組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內(nèi)約有 20000 個核糖體，而真核細胞內(nèi)可達 106 個，在未成熟的蟾蜍卵細胞內(nèi)那么高達 1012。核糖體和它的輔助因子為蛋 白質(zhì)合成提供了必要條件。1. 核糖體的組成原核生物核糖體由約 2/3的RNA及 1/3的蛋白質(zhì)組成。真核生物核糖體中RNA占 3/5，蛋白質(zhì)占2/5。核糖體是一個致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個亞基，每個亞基都含有一個相對分子質(zhì)量較大的rRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。大腸桿菌核糖體小亞基

50、由 21種蛋白質(zhì)組成，分別用 S1S21表示，大亞基由33種蛋白質(zhì)組成，分別用 L1L33表示。真核生物細胞核糖體 大亞基含有 49種蛋白質(zhì)，小亞基有 33種蛋白質(zhì)。2. rRNA3. 核糖體的功能核糖體包括至少5個活性中心，即 mRNA吉合部位、結(jié)合或接受 AA- tRNA部位A位、結(jié)合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位P位及 形成肽鍵的部位轉(zhuǎn)肽酶中心，此外還有負責肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點。小亞基上擁有mRNA吉合位點，負責對序列特異的識別過程，如起始位點的識別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負責氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA- tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合

51、等。A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。核糖體可解離為亞基或結(jié)合成 70S/80S 顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成 70S/80S 顆粒，繼續(xù)翻譯進程。體外反響體系中， 核糖體的解離或結(jié)合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2+濃度在10-3mol/L以下時，70S解離為亞基，濃度達10-2mol/L時那么形成穩(wěn)定的70S顆粒。細胞中大多數(shù)核糖體處于非活性的穩(wěn)定狀態(tài)，單獨存在，只有少數(shù)與mRNA-起形成多聚核糖體。它從 mRNA勺5'末端向3'末端閱讀密碼子，至終止子時合成一條完整的多肽鏈。mRNAk核糖體的多少視 mRNA勺長短而定，一般 40個核

52、苷酸有一個核糖體。七 . 信使核糖核酸mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRN/在所有細胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過三聯(lián)子密碼翻譯生成蛋白質(zhì)，其生物合成的具體過程和成熟mRNA勺結(jié)構在原核和真核生物細胞內(nèi)是不同的。八、蛋白質(zhì)的生物合成核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，mRNA!蛋白質(zhì)合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AA-tRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA mRNAO 100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過程。蛋白質(zhì)合成消耗了

53、細胞中 90%左右用于生物合成反響的能量。細菌細胞中的2 萬個核糖體， 10萬個蛋白質(zhì)因子和 20萬個 tRNAs 約占大腸桿菌干重的 35%。在大腸桿菌中合成一個 100個氨基酸的多肽只需 5 分鐘。1. 蛋白質(zhì)生物合成的主要步驟：翻譯的起始一一核糖體與mRNA吉合并與氨基酰-tRNA生成起始復合物。肽鏈的延伸一一核糖體沿mRNA5端向3'端移動，導致從 N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放一一核糖體從mRNAk解離，準備新一輪合成反響。主要分為五步1、Activation of Amino Acids (This reaction takes place in the c

54、ytosol, not on the ribosome).2、 Initiation.The mRNAbearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation. Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release. Completion of the polypeptide chain is signaled by a termi

55、nation codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步 Binding of an incoming aminoacyl-tRNA. Peptide bond formation. Translocation.2. 與蛋白質(zhì)合成有關的因子起始因子Initiation factor( IF)延伸因子 Elongation factor(EF)終止因子。原核中有 RF1-3。RF-1識別UAA和UAG; RF-2識別UAA和UGA; RF-3僅能促進RF-1和RF-2的功能。終止因子行使功能時需要G

56、TP真核生物中只有一個RF，能識別3個終止子。3、蛋白質(zhì)合成的起始蛋白質(zhì)合成的起始復合物 :30S 核糖體小亞基模板 mRNAfMet-tRNAfMet起始因子GTP50S 核糖體大亞基Mg2+合成的起始可分為三步 :1、 30S核糖體小亞基與起始因子IF -1和IF-3相結(jié)合，誘發(fā)模板 mRNAf小亞基結(jié)合。2、 由30S小亞基、起始因子IF - 1和IF-3及模板mRNA所組成的復合物立即與GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相結(jié)合。反密碼子與密碼子配對。3、 上述六組分復合物再與50S大亞基結(jié)合，水解 GTP生成并釋放GDF和Pi。釋放三個起始因子。表 27-9 真核細胞中參與翻

57、譯起始的蛋白質(zhì)因子及其功能真核因子 功能eIF2促進Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結(jié)合。eIF2BeIF3是最早與核糖體40S小亞基結(jié)合的促進因子，蛋白質(zhì)合成反響的正常進行。eIF4A具有RNA解旋酶活性，解除 mRNA模板的次級結(jié)構并使之與40S小亞基結(jié)合，形成 eIF4F復合物。elF4B與mRNA!板相結(jié)合，協(xié)助核糖體掃描模板序列，定位AUGeIF4E 與 mRNA 5'的帽子結(jié)構相結(jié)合，形成eIF4F 復合物。eIF4G與eIF4E和poly (A)結(jié)合蛋白(PAB相結(jié)合，形成 eIF4F復合物。eIF5促使多個蛋白因子與 40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結(jié)合形成80核糖體，形成翻譯起始復合物。eIF6促進沒有蛋白質(zhì)合成活性的80S核糖體解離成40S