項(xiàng)目實(shí)訓(xùn)手冊(cè)-項(xiàng)目1-牛乳中金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)解析

1、微生物檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)資源庫(kù)微生物檢驗(yàn)技術(shù)課程實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)手冊(cè)項(xiàng)目一 牛乳中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)（依據(jù) GB 4789.10-2010 第一法）一、實(shí)訓(xùn)目的掌握按照國(guó)標(biāo)進(jìn)行食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)和判定，學(xué)會(huì)樣品的制備和處理方法， 掌握金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)的程序及要點(diǎn)，掌握金黃色葡萄球菌在分離平板上的菌落特征 以及血漿凝固酶試驗(yàn)的操作過(guò)程及結(jié)果判定，學(xué)會(huì)按照二級(jí)采樣方案對(duì)金黃色葡萄球菌定性 檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。二、實(shí)訓(xùn)原理即一般的檢驗(yàn)流程是：增菌-平板分離-鑒定。其中增菌，進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)，允許金 黃色葡萄球菌持續(xù)增殖，同時(shí)阻止大多數(shù)其他細(xì)菌的增殖；平板分離，采用可抑制非金黃色 葡萄球菌生長(zhǎng)的

2、固體選擇性培養(yǎng)基和血平板，提供肉眼可見(jiàn)的疑似金黃色葡萄球菌的純菌落 和溶血現(xiàn)象；最后通過(guò)菌體形態(tài)觀(guān)察、血漿凝固酶試驗(yàn)進(jìn)行鑒別和判定。三、實(shí)訓(xùn)要求本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目操作標(biāo)準(zhǔn)依據(jù) GB 4789.10-2010第 一法。本項(xiàng)目全面考察學(xué)生對(duì)牛乳中沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)施過(guò)程中所涉及樣品處理，增菌，平板分離，鑒定等3個(gè)環(huán)節(jié)整體把握和運(yùn)用能力以及在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的操作文明和操作安全意識(shí)。本項(xiàng)目按4人 /組為單位進(jìn)行操作，要求按照無(wú)菌操作完成樣品的處理過(guò)程，正確配制培養(yǎng)基和試劑，學(xué)會(huì)樣品的接種，液 -液接種，平板劃線(xiàn)以及相應(yīng)的鑒定試驗(yàn)（如染色鏡檢，血漿凝固酶試驗(yàn)等），掌握金黃色葡 萄球菌在各分離平板上的典型特征和

3、溶血試驗(yàn)現(xiàn)象，學(xué)會(huì)原始記錄的書(shū)寫(xiě)以及結(jié)果的判定。四、實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備有：天平、均質(zhì)器、超凈工作臺(tái)、生物安全柜、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、顯微鏡。2. 實(shí)驗(yàn)用具金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)用具有：無(wú)菌吸管、微量移液器及吸頭、無(wú)菌試管、接種環(huán)。3. 培養(yǎng)基及試劑金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)用到的培養(yǎng)基及試劑有：（1）增菌試劑：7.5%氯化鈉肉湯。增菌可使用7.5漁化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大 豆肉湯，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長(zhǎng)，而除某些嗜高鹽的 海洋菌外，大多數(shù)細(xì)菌都能被增菌液中的高鹽所抑制。(2) 分離平板：血瓊脂平板和 baird-p

4、arker ( BP瓊脂平板；其中BP瓊脂培養(yǎng)基需按 照95mL的倍數(shù)配制，高壓滅菌后，冷卻至 50C,每95mL加入預(yù)熱50C的卵黃亞碲酸鉀增菌 劑5mL搖勻后傾注平板，培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的，使用前在冰箱保存不得超過(guò) 48h。(3) 純化平板：營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板或營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面。本實(shí)驗(yàn)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(4) 鑒定試劑：革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯(BHI)、凍干兔血漿。4、實(shí)驗(yàn)室要求及個(gè)人防護(hù)用品實(shí)驗(yàn)室要求：實(shí)驗(yàn)根據(jù)GB 4789.1-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 總則中要求，一般樣 品檢驗(yàn)在潔凈實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，病原微生物分離鑒定在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室( BSL-2)中進(jìn)行。 該實(shí)訓(xùn)要求

5、，樣品處理與增菌在無(wú)菌室中進(jìn)行，分離鑒定在 BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。無(wú)菌室個(gè)人防護(hù)用品有：無(wú)菌工作服、一次性口罩、帽子和無(wú)粉乳膠手套。BSL-2實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)用品有：防滲透工作服，一次性口罩(有條件者備N(xiāo)95 口罩)、帽子、無(wú)粉乳膠手套及聚氯乙烯手套各 1畐嘰五、實(shí)訓(xùn)任務(wù)1、無(wú)菌室消毒和準(zhǔn)備前增菌需在潔凈區(qū)域中進(jìn)行，無(wú)菌室的消毒和準(zhǔn)備如下： 進(jìn)入無(wú)菌室緩沖間，將樣品和增菌液放入傳遞窗中，打開(kāi)傳遞窗紫外燈進(jìn)行表面殺菌。 進(jìn)入已進(jìn)行整體消毒過(guò)的無(wú)菌室，用75%酒精棉擦拭工作臺(tái)面，將消毒水廢液缸等常 用物品放置在臺(tái)面上。開(kāi)啟無(wú)菌室的紫外燈，輻照滅菌 30min后，關(guān)閉無(wú)菌室和傳遞窗的紫 外燈。 進(jìn)入

6、無(wú)菌室緩沖間，更換無(wú)菌工作服，戴一次性帽子、口罩和無(wú)菌手套，穿上鞋套， 用75%酒精棉徹底消毒雙手，取出傳遞窗內(nèi)的物品，放在工作臺(tái)面上，進(jìn)行后續(xù)操作。2、樣品處理與增菌在已進(jìn)行消毒的無(wú)菌室內(nèi)，以75%酒精擦拭樣品外包裝，尤其是包裝的開(kāi)口處，用無(wú)菌 剪刀在樣品封口處剪開(kāi)包裝袋，打開(kāi)盛有 225mL7.5%氯化鈉肉湯的樣品瓶，用量程為 10mL 的無(wú)菌吸管量取25mL牛奶樣品至樣品瓶中，充分振搖混勻。若樣品為固態(tài)，需用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min。處理完畢的樣品通過(guò)傳遞窗出無(wú)菌室，清 理無(wú)菌室，打開(kāi)紫外燈，輻照滅菌 30 min。將上述處理好的檢測(cè)樣品放于預(yù)先設(shè)置 36 C± C的恒溫恒濕

7、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h24h。3、平板分離(1) BSL-2實(shí)驗(yàn)室消毒與準(zhǔn)備病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在 BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，BSL-2實(shí)驗(yàn)室的消毒與準(zhǔn)備如下： 進(jìn)入BSL-2實(shí)驗(yàn)室緩沖間，做好個(gè)人防護(hù)，將增菌所用無(wú)菌試劑放入BSL-2緩沖間的傳遞窗中，打開(kāi)傳遞窗紫外燈進(jìn)行表面殺菌。 進(jìn)入已進(jìn)行整體消毒過(guò)的BSL-2實(shí)驗(yàn)室，用75%酒精棉擦拭生物安全柜臺(tái)面，依次開(kāi) 啟生物安全柜和BSL-2實(shí)驗(yàn)室的紫外燈，輻照滅菌1小時(shí)后關(guān)閉。 進(jìn)入BSL-2實(shí)驗(yàn)室緩沖間，更換防滲透防護(hù)衣，戴一次性帽子、口罩和無(wú)菌手套，穿 上鞋套，取出傳遞窗內(nèi)的物品，放在工作臺(tái)面上。進(jìn)行后續(xù)操作。注意：操作時(shí)避免雙臂頻 繁穿過(guò)氣

8、幕破壞氣流。(2) 平板分離金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，污染嚴(yán)重時(shí)在 10%氯化鈉胰酪胨大 豆肉湯內(nèi)呈混濁生長(zhǎng)。在已進(jìn)行消毒的生物安全柜內(nèi)用接種環(huán)取培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯，分別劃線(xiàn)接種到BP平板和血平板，于36± C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h24h，BP平板有時(shí)需要延 長(zhǎng)至45h48h。本實(shí)驗(yàn)中各分離平板上的菌落特征如下：BP平板：菌落直徑為2 mm3 mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐换鞚釒В?在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹(shù)膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解 的類(lèi)似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。BP培養(yǎng)基中含有卵黃、氯化鋰和亞碲酸鉀，能抑制大多

9、 數(shù)細(xì)菌的繁殖，而丙酮酸鈉和甘氨酸能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)使其產(chǎn)生黑色和暈圈。長(zhǎng) 期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀(guān)可能粗糙并 干燥。血平板：菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色(有時(shí)為白色)，菌落周?chē)梢?jiàn)完全 透明溶血圈。金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，使血瓊脂平板菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)，這是鑒 定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。4、鑒定(1)染色鏡檢取潔凈載玻片，于其上滴加1滴生理鹽水，用接種環(huán)將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀(guān)察形態(tài)。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，直 徑約為 0.5 yrml(2)血漿凝固酶試驗(yàn)挑取B

10、P平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5 mL BHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板， 36±C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h24 h。取BHI培養(yǎng)物0.20.3 mL加入到已用0.5 mL無(wú)菌生理 鹽水完全溶解的凍干兔血漿安瓿瓶中，振蕩搖勻，加入0.5 mL無(wú)菌生理鹽水至完全溶解，再加入BHI培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL,振蕩搖勻， 置36±°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每半小時(shí)觀(guān)察一次，共觀(guān)察6 h，如兔血漿呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。由于病原性葡 萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成

11、 凝塊。凝固酶試驗(yàn)是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。注意：測(cè)試時(shí)須同時(shí)以血漿凝固酶試 驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的新鮮肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照，建議陽(yáng)性菌株可選擇金黃色葡萄球 菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538，陰性菌株可選擇表皮葡萄球菌或白色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。本實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和待檢菌均為凝固，表皮葡萄球菌不凝固，判定該待檢 菌為陽(yáng)性。結(jié)果如可疑，可再挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的菌落到5 mL BHI ,36±C培養(yǎng)18 h48 h，重復(fù)本試驗(yàn)以進(jìn)行確認(rèn)。5、金黃色葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌腸毒素是一種重要的致病物質(zhì)，是引起的食物中毒的重要原因。近年報(bào) 導(dǎo)顯示，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在

12、實(shí)驗(yàn)室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且1個(gè)菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素?？梢墒澄镏卸緲悠坊虍a(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌 株的鑒定，可按標(biāo)準(zhǔn)附錄B進(jìn)行葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)。6、結(jié)果與報(bào)告染色鏡檢和血漿凝固酶特征符合金黃色葡萄球菌特征的，可判定為金黃色葡萄球菌。結(jié) 果報(bào)告為：在25 g ( mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。本實(shí)驗(yàn)在血平板和BP平板上的菌落形態(tài)典型，經(jīng)染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄 串狀排列，血漿凝固酶陽(yáng)性，可判定為檢出金黃色葡萄球菌，結(jié)果報(bào)告為25mL樣品中檢出。填寫(xiě)原始記錄單和報(bào)告。根據(jù)GB4789.1-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 總則要求檢驗(yàn)后樣品要進(jìn)

13、 行無(wú)害化處理。4微生物檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)資源庫(kù)8六、原始數(shù)據(jù)記錄表金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)原始記錄樣品編號(hào)樣品名稱(chēng)樣品狀態(tài)固態(tài)，無(wú)異常 液態(tài)，無(wú)異常 其他：樣品數(shù)量溫度C濕度檢驗(yàn)方法檢測(cè)地點(diǎn)主要檢測(cè)儀器 名稱(chēng)及編號(hào)分析前設(shè)備狀態(tài)正常異常分析后設(shè)備狀態(tài)正常異常主要培養(yǎng)基和試劑檢驗(yàn)項(xiàng)目測(cè)試數(shù)據(jù)記錄檢驗(yàn)結(jié)果技術(shù)指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)論金黃色葡萄 球菌檢樣 25g(ml) + 225 ml7.5% 氯 化鈉肉湯(36±1C, 1824h)培養(yǎng)結(jié)果血平板(36 ±1 C, 1824h)培養(yǎng)結(jié)果Baird-parker 平板(36 ±1 C, 1824h)培養(yǎng)結(jié)果革蘭氏染色結(jié) 果和菌落形態(tài) 25g (mL)樣品中未檢出 25g (mL)樣品中檢岀n=5c= m=M=符合不符合顏色清澈混濁生長(zhǎng)無(wú)可疑菌