基因克隆考試預(yù)測(cè)題

1、一、請(qǐng)任意列舉不少于三個(gè)基因克隆技術(shù)在生物學(xué)與醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，并且解釋原理。1、蛋白定位將抗體制作為探針，加熒光標(biāo)記后將抗體注入細(xì)胞，進(jìn)行放射自顯影，從而定位蛋白質(zhì)。2、啟動(dòng)子活性研究一種帶有某些標(biāo)記可供篩選的載體，如載體上面有-半乳糖苷酶基因的載體，將載體上原本的啟動(dòng)子替換為你認(rèn)為有啟動(dòng)子活性的序列，構(gòu)建重組載體，檢測(cè)-半乳糖苷酶表達(dá)活性來判斷目的序列的啟動(dòng)活性。真核上面一般用熒光素酶報(bào)告載體，用表達(dá)的熒光素酶多少與底物發(fā)光的強(qiáng)弱來判斷目的序列的啟動(dòng)活性。（1）蛋白定位。啟動(dòng)子要研究蛋白GFP蛋白定位（2）基因敲除小鼠。通過外源DNA與染色體之間的同源重組，進(jìn)行精確地定點(diǎn)修飾和基因改造。（3）

2、基因療法。利用健康的基因來填補(bǔ)或替代基因疾病中某些缺失或病變的基因。二、請(qǐng)描述基礎(chǔ)基因克隆技術(shù)的大體步驟，并且描述PCR過程中可能發(fā)生的問題，以及簡(jiǎn)單的應(yīng)對(duì)方法1、找：找到DNA片段。利用生物信息學(xué)、NCBI數(shù)據(jù)庫、BLAST查找基因。2、拉：PCR擴(kuò)增。3、剪：酶剪切4、連：DNA連接5、轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)化PCR結(jié)果產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，解決方法是在PCR中先將模版同引物在高于兩者變性溫度的條件下處理一段時(shí)間，然后將酶和其他成分加入擴(kuò)增，用以消除非特異性產(chǎn)物的方式，即Hot Start PCR三、1. 一個(gè)學(xué)生想試圖克隆一段DNA片段到一個(gè)載體DNA上，請(qǐng)幫助這個(gè)學(xué)生識(shí)別這個(gè)載體，這是一個(gè)什么功能的載體，

3、用于什么生物，抗性基因是什么？ 已知XbaI為此載體唯一可以用于克隆的酶切位點(diǎn)，請(qǐng)說明如何預(yù)防載體自身黏合？2. 這個(gè)學(xué)生將1000bp DNA片段克隆了在這個(gè)載體上的XbaI位點(diǎn)，但是當(dāng)他做酶切檢驗(yàn)時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)1000bp的DNA片段，后期DNA測(cè)序證實(shí)DNA片段已經(jīng)成功的克隆在載體上。問，為什么當(dāng)他做酶切檢驗(yàn)時(shí)DNA片段不能被酶剪切下來？答：1、GFP：綠色熒光標(biāo)記蛋白（載體），可用于蛋白質(zhì)定位。哺乳動(dòng)物，因?yàn)镃MV是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子?？剐曰蚍謩e是氨芐（用于大腸桿菌基因克?。┖蚇eo(用于哺乳動(dòng)物抗性篩選)?？捎脡A性去磷酸酶去除末端P，此時(shí)DNA連接酶不能連接，可以防止自身粘合CMV啟動(dòng)子/

4、增強(qiáng)子被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高效真核表達(dá)載體，CMV是大家公認(rèn)的啟動(dòng)真核基因表達(dá)的最有力量的啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物中表達(dá)活性高，因此用于哺乳動(dòng)物?？剐曰蚴茿mp。防止自粘合使用堿性去磷酸酶出去末端P，此時(shí)DNA連接酶不能連接，可以防止自粘合。（結(jié)合圖說明）2、Dam-Dcm 甲基化酶無法介入，因此不能被剪切XbaI: T/CTAGAATGGTCGT TCTAGA TCGAGTGCTATGGTCGA TCTAGACCGAGTGCT四、一個(gè)學(xué)生想要在E.Coli中表達(dá)蛋白X，之后利用GST-fusion的方式將蛋白提純。請(qǐng)幫這個(gè)學(xué)生設(shè)計(jì)出一個(gè)可用于DNA克隆和蛋白表達(dá)的載體。請(qǐng)解釋IPTG誘導(dǎo)

5、的工作原理。并且請(qǐng)畫出預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這個(gè)學(xué)生在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)非常的低，請(qǐng)問有什么辦法可以將蛋白表達(dá)含量提升？請(qǐng)解釋為什么。CMV啟動(dòng)子GFPoriNEOAMPMCS1、2、3、A、密碼子優(yōu)化其他物種的密碼子，大腸桿菌利用率低，將其優(yōu)化成大腸桿菌的密碼子。最佳密碼子（optimal codons）稀有或利用率低密碼子B、延長(zhǎng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間，原因是IPTG誘導(dǎo)時(shí)間過短，導(dǎo)致表達(dá)低。延長(zhǎng)IPTG時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)，表達(dá)量多。C、加大細(xì)胞濃度，原因是細(xì)胞少，表達(dá)能力有限，增大細(xì)胞濃度，提升表達(dá)量。五、一個(gè)學(xué)生在小鼠中敲除基因。請(qǐng)簡(jiǎn)單敘述小鼠基因敲除的原理。在敲除基因后他發(fā)現(xiàn)新孕育的小鼠在胚胎

6、發(fā)育過程中死亡。他還有什么方法來敲除此基因？請(qǐng)解釋原理。六、已知酵母菌Saccharomyces cerevisiae的基因型為ura-, trp-, met-,請(qǐng)問以下哪些載體可以用于基因表達(dá)？請(qǐng)問你選擇的依據(jù)是什么？請(qǐng)解釋GAL啟動(dòng)子是什么？其工作原理是什么？答：1、Neo 、Ura 和TRPIU和T合成U和T的酶，Neo是抗新霉素的抗藥基因，一般用來作為基因表達(dá)載體的篩選。trp操縱子是負(fù)責(zé)色氨酸合成的操縱子。trp操縱子是由一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)操縱基因區(qū)組成。該操縱基因控制一個(gè)編碼色氨酸生物合成需要的5種蛋白的多順反子mRNA的表達(dá)。2、GAL啟動(dòng)子是半乳糖啟動(dòng)子七、1.請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)克隆引物AT

7、GCGTAGCTAGCCGATGTCAGGTAGCTGATGCTGTAGTGCATGTAA答：1bamH1+ATGCGTAGCTAGCCGATGTCAGGTAGCTGATGCTGTAGTGCATGTAATACGCATCGATCGGCTACAGTC CATCGACTACGACATCACGTACATT+ bamH1bamH1+ATGCGTAGCTAGCCGATGTCAGbamH1+TTACATGCACTACAGCATCAGCTAC2.請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)克隆方法（不少于兩種）ATGCGTAGCTAGCCGATGTCAGGTAGCTGATGCTGTAGTGCATGTAA答：1. Partial Digestion不完全酶切2. Fusion Cloning（lecture 3）八、一位老師的研