浙液相色譜講義四：梯度方法的開發(fā)及梯度分離時的注意事項

1、液相色譜的方法開發(fā)液相色譜的方法開發(fā)（二）梯度方法梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點優(yōu)點.單位時間的分離能力增加.檢測靈敏度提高缺點.儀器設備要求高.不適合某些檢測方式.柱需再生.定量分析的重復性較低梯度的洗脫方式梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度溶劑 a溶劑 b泵 a泵 b混合器a 高壓梯度溶劑 a泵溶劑 b比例閥（溶劑混合點）混合器b 低壓梯度（溶劑混合點）梯度洗脫的可變參數梯度洗脫的可變參數a及b液的成分和化學特性梯度的陡度梯度的變化形狀124356789 10 11如不用梯度：分離不理想如不用梯度：分離不理想梯度條件的優(yōu)化梯度條件的優(yōu)化梯度曲線壓力曲線梯度曲線的變化梯度曲線的變化 凹線凹線梯度

2、曲線的變化梯度曲線的變化 凸線凸線梯度平衡時間的影響（一）梯度平衡時間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時間色譜圖不重復梯度平衡時間的影響（二）梯度平衡時間的影響（二）平衡時間6分鐘平衡時間7分鐘平衡時間8分鐘平衡時間9分鐘 平衡時間從6到7分鐘，第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個時間時，平衡充足。有機污染物的影響（一）有機污染物的影響（一）50ml超純水的有機物污染狀態(tài)有機污染物的影響（二）有機污染物的影響（二） “三蒸水”有大量的有機污染物不適合梯度分析有機污染物的影響（三）有機污染物的影響（三） 典型的“實驗室水”有大量的

3、有機污染物不適合高靈敏度梯度分析梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第一步第一步 開發(fā)一個有9個烷基苯酮化合物的梯度方法，用c18柱，在最初的條件下(0-100% 水-乙腈)，分離不理想。整個色譜峰組保留時間太長，分離度也不好。梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第二步第二步 為使色譜峰前移，提高起始時乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個化合物出了10個色譜峰，說明有雜質存在，很可能是流動相水中的。梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第三步第三步 從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測靈敏度下，共有兩個雜質峰。說明流動相水中的雜質在此條件下可能會對檢測有影響。梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第四步第四步 空白梯度圖同樣品的色譜圖進行對照后，我們看到雜質（共兩個峰）中的第一個小峰對第8個色譜峰有干擾，會使其定量分析結果不準確。梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第五步第五步 根據“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前(曲線5，50-100%b)，但是小峰仍沒有分出來。梯度方法開發(fā)實例梯度方法開發(fā)實例 - 第六步第六步 根據“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號峰提前，改用50