乳酸菌菌種的分離篩選方法

1、乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌通稱。 為兼性厭氧菌， 桿狀 或球狀，革蘭氏陽性菌， 無芽孢，不運動。營養(yǎng)要求高， 需要提供豐富的肽類 氨 基酸 維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。 通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、 干酪乳桿菌、 植物乳桿菌、 嗜酸乳 桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類 時，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對于芽抱乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。 嗜酸乳桿菌

2、屬于乳桿菌屬的一個種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運動，無 鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細胞呈球狀，直徑 0.61.0卩m在直角兩個平面交替形成四聯(lián)狀， 一般細胞成對生， 單生者罕見， 不成鏈狀排列。 革蘭氏陽性， 不運動，兼性厭氧。 在MRSW養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀。 乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落， 不易觀察， 所以分離時先富集培養(yǎng)并 選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫 -80 等物質(zhì)，也 常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細菌生長，對乳酸菌無害。 培養(yǎng)基中添加碳酸鈣， 乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈， 作為分

3、離鑒別的 依據(jù)，通過對生成的乳酸量進行性能鑒定。乳酸菌生長繁殖時需要多種氨基酸， 維生素及微氧， 一般菌落比較小。 分離培養(yǎng) 基一般可添加西紅柿 酵母膏 油酸 吐溫等物質(zhì)，均具有促進生長作用。也常常 添加醋酸鹽抑制有些細菌的生長，對乳酸菌無害。一 . 篩選方法：1 .溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細菌在含CaC03勺培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3溶解圈，從而篩選出這 些產(chǎn)酸類細菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入CaC03勺作用是：鑒別能產(chǎn)生酸的細菌；中和產(chǎn)生的酸， 以維持培養(yǎng)基的 PH。篩選過程：樣品預(yù)處理一梯度稀釋至 10-6 一選擇合適的稀釋度涂布一 37 C培養(yǎng)48h-挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在

4、 MRS9養(yǎng)基上劃線一挑起單菌落染色，經(jīng)鏡 檢確認(rèn)為純種-挑選革蘭氏陽性單菌落一試管穿刺4C冰箱保存。2. 溴甲酚綠指示劑法：培養(yǎng)基： MRS培養(yǎng)基（含溴甲酚綠酒精溶液） 篩選過程：同上，不同之處是稀釋涂布后長出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌 落。二. 菌種的分離篩選1. 培養(yǎng)基：1.1 麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基：麥芽汁（ 10BX） 1L 預(yù)先滅菌碳酸鈣 5-10g/L PH 自然 （分離用） 1.2 牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁 200g/L 葡萄糖10g/L 吐溫 0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚綠 0.01% PH6.0-6.5 （分離用）1

5、.3 番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基：酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁 100mL 蛋白胨 7.5g/L KH2PO42.0 g/L 吐溫 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分離用）1.4 葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.51.5 蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/LMgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO 4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.51.6 蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L

6、 玉米漿 0.5- 1.0g/LKH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO 4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5（發(fā)酵或種子培 養(yǎng)基） 1.7 MRSt養(yǎng)基 （分離培養(yǎng)計數(shù)用） 蛋白胨 10.0g 、牛肉膏 10.0g 、 酵母膏 5.0g 、 檸檬酸氫二銨 2.0g 、葡萄糖 20.0g 、 吐溫 80 1.0mL 、 乙酸鈉 5.0g 、 磷酸氫二鉀 2.0g 、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂18.0g、蒸餾水1L, pH 6.5。（分離培養(yǎng)基）， 當(dāng)MRS培養(yǎng)基冷卻至4550C時,加入已滅菌的碳酸鈣,充分混勻，倒平板。1

7、.8 BCP 培 養(yǎng)基 （ 溴甲酚紫培養(yǎng)基 ）乳糖5.0g 蛋白胨5.0g酵母膏3.0g 0.5%溴甲酚紫10ml自來水1000mlpH6.5-7.0（分離用）1.9 BC倂乳營養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉10g,溶于50ml水中，加入1.6 %溴甲酚綠酒 精溶液0.07ml, 0.075Mpa 20min。另取瓊脂2.0 g,溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g 溶解后調(diào) pH6.5-6.8 ， 0.1 Mpa 20min. 趁熱在無菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37°C培養(yǎng)24h,檢查是否有雜菌。2. 分離篩選：2.1富集培養(yǎng)：取1.0g（ 1.0ml）于無菌細口瓶中，加入無菌 麥芽汁液體培

8、養(yǎng)液 于瓶口處，密閉，25-32 C培養(yǎng)48h。若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀， 革蘭氏陽性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接2-3次，接種量3-5 % .2.2 菌種分離純化：溶鈣圈法：富集菌液或樣品適當(dāng)稀釋至10-7，混菌法分離，先加入10-12ml MRS培養(yǎng)基或麥 芽汁培養(yǎng)基，凝固后再注入4-5ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，30C或37C 培養(yǎng) 2-3 天（溫度低時間稍長） ，可出現(xiàn)針頭狀或圓形稍扁菌落，周圍形成透明 圈。挑取透明圈大，培養(yǎng)基變黃的菌落， 反復(fù)劃線純化 2-3 次，所得單菌落編 號，經(jīng)鏡檢后，疑似乳酸菌落接種于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后保存?zhèn)溆??；蚪尤胍后w培 養(yǎng)基中，25

9、-32 C培養(yǎng)24-48h，然后穿刺于MRS培養(yǎng)基或麥芽汁碳酸鈣半固體培 養(yǎng)基中，25-32 C培養(yǎng)48h保存?zhèn)溆谩?.3 性能測定：乳酸菌定性試驗：不同條件下的產(chǎn)酸速率試驗：將分離菌種接種于MRSt體培養(yǎng)基中25 C 37 C溫 度下培養(yǎng)測不同菌株不同溫度的 pH。方法1.吸取發(fā)酵液10ml，注入空試管中，加入10%硫酸1.0ml，在加入2.0 %高錳酸鉀約 1.0ml ，此時乳酸轉(zhuǎn)化成乙醛。取濾紙一條，在含氨的硝酸銀 溶液中浸濕，橫搭在試管口上，將試管徐徐加熱至沸騰，使乙醛揮發(fā)，若管口濾 紙變黑，證明有乳酸生成。方法 2. 紙層析法：展開劑為正丁醇：甲醇：水 =80：15： 5，毛細血管吸

10、取發(fā)酵液，多次點樣于新華濾紙上，1.5 %標(biāo)準(zhǔn)乳酸為對照，平衡2小時后進行層析，3 %溴甲酚藍顯色計算Rf值。產(chǎn)酸量測定：5.0 ml發(fā)酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸餾水10-20ml，酚酞指 示劑 2 滴，用 0.1mol/l 氫氧化鈉滴定至微紅色。醋酸量（g/100mL）=氫氧化鈉摩爾濃度.Vx90.08x10-3 /樣品毫升數(shù) x100同時，進行單因素試驗，分別考察醋酸速度，耐高溫，耐酒精度，耐低酸度等主 要生產(chǎn)性能，選擇優(yōu)勢菌株。3. 菌株鑒定：3.1 菌落形態(tài)：3.2 菌體形態(tài)：（革蘭氏染色觀察）染色鏡檢：桿狀 陽性。3.3 乳酸菌運動性檢測：半固體穿刺法3.4 生理生化：3.3

11、.1 生化試驗： 產(chǎn)過氧化氫， 產(chǎn)硫化氫， 葡萄糖產(chǎn)生， 硝酸鹽還原， 產(chǎn)生吲哚， 甲基紅，明膠液化，需氧，精氨酸，糖發(fā)酵試驗。3.3.2 生理試驗：乳酸菌產(chǎn)酸能力曲線：將篩選的乳酸菌接種于MRS®體培養(yǎng)基中，25-32 °C培養(yǎng)48h,間隔4-6h測定發(fā)酵液pH。食鹽對乳酸菌的影響：在MRS®體培養(yǎng)基中，添加0.0 % 2.0 % 4.0 % 6.0 %氯 化鈉，菌種分別接種于培養(yǎng)基中，32C培養(yǎng)48h，測定OD值。溴甲酚綠指示劑法： 原理：溴甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境呈藍色，分離培養(yǎng)基配制后PH為6.8，加入溴甲酚綠指示劑呈藍綠色，產(chǎn)酸后菌落周圍

12、變成黃色，較 容易鑒別。培養(yǎng)基： BCG乳營養(yǎng)瓊脂初篩：將樣品富集液梯度稀釋，適溫培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)扁平的黃色菌落及周圍 培養(yǎng)基也為黃色初定為乳酸菌。復(fù)篩：將典型菌落轉(zhuǎn)接脫脂乳發(fā)酵管，若凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞桿 狀或鏈球狀，革蘭氏染色陽性，連續(xù)傳代若干次培養(yǎng)，挑選出 3-4h 能凝固的乳 管保存?zhèn)溆谩Ｗⅲ?1. 乳酸菌篩選常在幾種培養(yǎng)基同時進行：分別在麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基，番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）同時進行混菌 劃線或涂布培養(yǎng)（放厭氧袋），分別 25C 37 C培養(yǎng)48h。菌落觀察： 平板表面形成淺色 （黃色或白色） 小菌落。麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基表面， 菌落周圍形成透

13、明圈，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）周圍使紫色的培養(yǎng)基形成 黃色包圍圈。觸酶反應(yīng)：厭氧菌一般無觸酶（過氧化氫酶），用滴管滴加3.0 %過氧化氫于菌落上，若無氣泡產(chǎn)生，證明該菌為觸酶陰性。將各種特征菌落分別接入斜面，培養(yǎng)后保存，進一步生理生化試驗，以鑒定分 別何種乳酸菌。2. 菌落鑒定：半固體或雙平板瓊脂利于乳酸菌的生長，菌落出現(xiàn)早。2.1 菌落形態(tài)觀察：乳白色 邊緣不整齊，稍呈半球狀凸起，實心菌落個體形態(tài)：半透明 細桿狀 鏈狀排列，大量時呈發(fā)絲狀堆積。初步認(rèn)為乳桿菌2.2生化鑒定：在吲哚試驗中，加入菌種試管無任何變化，為陰性反應(yīng)。說明該 菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。明膠液化 淀粉水解 氫氧化鉀試驗均為陰 性，說明此菌為乳酸菌。（過氧化氫酶還原硝酸鹽）糖發(fā)酵試驗：發(fā)酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖產(chǎn)酸為陽性反應(yīng)，其余麥芽糖 蔗 糖 棉子糖 鼠李糖產(chǎn)酸為陰性反應(yīng)。根據(jù)手冊第九版判斷此種乳酸菌為德氏乳 桿菌保加利亞亞種。（纖維二糖甘露醇山梨醇七葉苷水楊苷）2.3乳酸菌生長曲線pH-t測定結(jié)果：vwwjcw-coen 嗜酸乳桿帝乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上三.幾種乳酸菌篩選舉例1嗜熱鏈球菌：樣品來源：市售酸奶 培養(yǎng)基：M17改良培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：42C, 需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離2.保