人參果膠與半乳凝素

1、人參果膠與半乳凝素 -8 相互作用的構效關系研究果膠是一類存在于植物細胞壁中的酸性雜多糖 , 具有抗腫瘤、抗病毒、免疫 調節(jié)等生物活性 , 但其活性機理并不十分明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)果膠能夠結合 半乳凝素 , 為果膠活性機理的研究開辟了新的領域。半乳凝素是一類具有高度保守的糖基識別結構域 (CRD)、并且能特異性結合B -半乳糖苷的凝集素。半乳凝素家族中的半乳凝素-8(GAL8),作為一種調節(jié)細胞 粘附性的因子參與多種生理和病理過程。GAL8的過量表達會引起一些疾病。例如,在某些癌癥中高表達的GAL8可以 促進腫瘤細胞的增殖和血管的生成。但目前關于GAL8的抑制劑/調節(jié)劑的研究較少，果膠是否具

2、有抑制或調節(jié)GAL8的功能至今未見報道。因此,本論文以人參果膠為研究對象,探究了果膠與GAL8的相互作用及其構效關系。具體研究內容及結果如下 : 一、不同結構的人參果膠級分及其片段的制備和 結構分析。 (1) 人參果膠經過離子交換層析、凝膠過濾層析、果膠酶酶解等方法 處理,得到了 4個RG-I型果膠級分和4個HG型果膠級分。對RG-I型果膠級分2A-Dp進行部分酸水解,制備了含有不同側鏈結構的3個RG-I果膠片段。(3)采用高效液相和二維核磁等技術分析了 2A-Dp及其片段 的結構，結果表明，2A-Dp中的Ara主要以a -1,5糖苷鍵連接，部分Ara的C3位帶 有分支,Gal以B -1,4糖

3、苷鍵連接。結構片段2A-Dp-4和2A-Dp-12只含有B -1,4-Gal側鏈。二、果膠類寡糖的制備和結構分析。(1)為了獲得寡聚的B -1,4-Gal側鏈結構,以富含B -1,4-Gal的土豆半乳聚 糖為原料 ,通過部分酸水解和凝膠過濾層析 ,制備了聚合度從 2 到 15 的高純度系 列寡聚半乳糖 , 并利用質譜和二維核磁鑒定了其結構。 根據(jù)二維核磁結果 , 總結了 峰面積隨聚合度變化的規(guī)律。為了獲得同聚半乳糖醛酸片段,以富含a -1,4-GalA的向日葵果膠為原 料,通過酶解和凝膠過濾層析 ,制備了聚合度從 2到6的系列寡聚半乳糖醛酸。 三、 不同結構的人參果膠與 GAL8的相互作用的比

4、較。利用紅細胞凝集阻抑方法分析了各種果膠級分與GAL8的相互作用，發(fā)現(xiàn)人參果膠級分可以抑制GAL8與紅細胞間的作用。并利用生物膜干涉技術測定了其 結合的親合力,發(fā)現(xiàn)果膠能與GAL8結合,且RG-I型果膠級分與GAL8作用較強。四、RG-I型果膠與GAL8互作的構效關系。本論文分別從果膠結構和蛋白結 構的角度分別進行了研究。從果膠結構的角度：(1)RG-I型果膠級分2A-Dp及其三個結構片段與GAL8的相互作用的研究結果顯示,Ara在RG-I與GAL8相互作用中幾乎不發(fā)揮作用,Gal 側鏈是RG-I與GAL8結合所必須的結構。分析了 RG-I果膠的側鏈一一系列寡 聚半乳糖與GAL8的親和力,結果

5、表明寡聚半乳糖結合 GAL8的親和力與LacNAc 相當,RG-I型果膠與GAL8的高親和力是多條寡聚半乳糖側鏈共同作用的結果。(3)研究了 RG-I主鏈在互作中的作用，發(fā)現(xiàn)RG-I的主鏈不能與GAL8直接結 合,主鏈起骨架支撐的作用。從蛋白結構的角度,對GAL8的截短蛋白和突變體分 別與RG-I果膠級分2A-Dp的相互作用進行了比較研究。(1)乳糖抑制實驗結果顯示,乳糖能夠抑制RG-I果膠與全長GAL8的結合,說 明二者結合利用經典的 CRD吉構域。(2)2A-Dp與GAL8的兩個截短蛋白(N-CRD C-CRD和兩個突變體(R69H R233H)的結合親和力分析結果顯示，RG-I型果膠既可

6、以結合在GAL8的N-CRD也可以結合在C-CRD且結合在N-CRD勺親和力稍強。乳糖抑制結果表明,RG-I果膠結合在GAL8兩端CRD中乳糖結合位點。五、 RG-I型果膠側鏈結構與GAL8互作的晶體學研究。本論文通過對共結晶條件的篩選和優(yōu)化,成功獲得了 GAL8與寡聚半乳糖的 共晶體。利用 X 射線衍射晶體衍射技術對共晶體結構解析 , 發(fā)現(xiàn)寡聚半乳糖穩(wěn)定 地結合在經典的乳糖結合位點。寡聚半乳糖的非還原端 Gal和非還原端第二個Gal與GAL8的45位Arg,69 位Arg和89位Glu形成了穩(wěn)定的氫鍵。此外,本論文還發(fā)現(xiàn)GAL8的N端結構 (GAL8N,1-186aa)在結合半乳4糖時,N端前導序列形成了新的B折疊結構,被命 名為 F-1 。綜上所述 , 本論文以人參果膠作為研究對象 , 研究了果膠與半乳凝素 -8 相互 作用及其構效關系。首次報道果膠能結合并且抑制GAL8;RG-I(而非HG)吉構域是 果膠的活性成分 ,RG