測序結(jié)果分析

1、測序結(jié)果的判讀測序結(jié)果為.abi格式，可用軟件chrosmas打開，一種顏色的峰代表一個(gè)堿基，峰的高低表 信號(hào)的強(qiáng)弱。一個(gè)正常的N表示機(jī)器沒法判讀是哪種堿基，原因是：雜峰的信號(hào)高于機(jī)器默認(rèn)的值，機(jī)器會(huì)認(rèn)為該處有兩個(gè)峰，因此不能判斷確定是哪個(gè)峰，需要人工判讀。以下三 種情況會(huì)出現(xiàn)N：有雜合子，有雜峰，反應(yīng)已結(jié)束。31V，加|370> 內(nèi) G ftT A C C ft SGCG-TTTCCCCC TGGAifcGCTCCCTCGTGCGC TCTCCTfrTTCC G C 7 C T 5 C C G C *7 r質(zhì)粒污染(Two plasmid)iCTBTlFTTOliTCC" T

2、imCCOCCTT TCTTCOFCR：間 1TMC TUEMFWHHIIHfiT ffl I HfflFM： ITITCIME706040100110120 1SD 140 ISOPCR雜帶釘子峰產(chǎn)生的原因是樣品或毛細(xì)管內(nèi)有灰塵等固體小顆粒序列凌亂-1-11 11i JfLLI111J1|i11彳|!1隊(duì)114It3 rj ha11Hl"1I jy1f' 1 l'1 k 1 1-4-rlMWill原因：測序反應(yīng)失敗。解決辦法：改進(jìn)條件，重做反應(yīng)。注意兩個(gè)關(guān)鍵因素：引物與模板之間的比例：3.2 pmol:200 ng。模板 DNA的純度和用量：1.6 2.0T峰特別弱

3、原因：殘余的 Dye太多，純化不夠。有測序反應(yīng)，但效率低下信號(hào)太弱解決辦法：純化充分。避開引物峰，確定新的分析起點(diǎn)1、PCR產(chǎn)物測序時(shí)出現(xiàn)重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼）a c c > t a t c g t acacTT .ciiTTTTNaaNaa c c t to a <解決方法：將 PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測序，或?qū)?PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE 純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序。問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)

4、物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序，便可解決。|可題圖3（測序引物有堿基缺失）CT7 CC TtTW； C TC N 1 TTG CTTC CCG775KG !T CM TC測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖 1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化2、克隆測序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊原因：所挑選的重組子不是

5、單克隆，所提供的測序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落 （劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y序。3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)A G O C T -C T -C C TT G HaTOTGTG模板中有雜合型突變， 也就說模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失）,那么測序圖形中其他的位黑占一般都是罩一的峰形，然后突然在某一彳固位黑占出現(xiàn)重疊峰（如圖中箭所示）。解決方法：建議將 DNA片段克隆到載體再測序。4、polyA/T 和C/Gcluster 導(dǎo)致的套峰和測序信號(hào)衰減TTTTTTTTTTTTTTTCT<JTTTTTTTT(JTT-gT<jawww.blTTTTTTMCCCi XM ： C C MRACE測序時(shí)經(jīng)常遇到圖 4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；或者構(gòu)建載體 進(jìn)行測序。5、基因中含有重復(fù)序列Ct7 7CC7 CCC!枕。：Ct C t - CCC：CCCft CCCT :CC T ' XCJ CtC： H CCCT :CC： OCC：可能的原因：樣品中含有重彳復(fù)序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致 Frame滑動(dòng)，較短的重彳復(fù)