干旱脅迫對植物生理生化指標的影響

1、2014-2015學(xué)年上學(xué)期植物生理學(xué)實驗科技論文題目干旱脅迫對小麥生理生活指標的影響姓名張蓉娜學(xué)號 124120249院、 系生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物教育專業(yè)12應(yīng)用生物教育A班任課教師 李忠光（教授）二0一四年十二月干旱脅迫對小麥生理生化指標的影響12 應(yīng)用生物教育 A 班 張蓉娜 124120249摘要：干旱脅迫是影響小麥產(chǎn)量的重要脅迫因素，而干旱脅迫對小麥生理 生化指標有顯著影響。 通過對干旱脅迫下的小麥幼苗與正常小麥幼苗中的脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、 還原型谷胱甘肽（GSH）的提取與含量測定分析，實驗結(jié)果表明：干

2、旱脅迫下的小 麥幼苗的脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、多酚氧化酶（PPO）、過 氧化物酶（POD）、還原型谷胱甘肽（GSH）的含量均比正常小麥幼苗的含量高，證 明干旱脅迫對小麥生理生化指標有影響。關(guān)鍵詞： 干旱脅迫、小麥、生理指標引言： 目前全球干旱、半干旱地區(qū)約占土地總面積的36,占耕地面積的43，大多數(shù)國家都面臨水資源危機，我國也不例外 1。干旱在我國分布廣泛， 一年四季均有可能發(fā)生， 對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響十分嚴重。 小麥是世界上僅次于玉米的 第二大糧食作物，世界上約有 70的小麥播種面積分布在干旱、 半干旱農(nóng)業(yè)區(qū) 2。 如果干旱發(fā)生在小麥開花期或者灌漿期， 就會導(dǎo)致其

3、灌漿期減短、 產(chǎn)量嚴重減少 3。其在生長過程中，經(jīng)常會受到干旱的影響，在世界范圍內(nèi)，由于水分所造成 的減產(chǎn)，可能要超過其他因素所導(dǎo)致的產(chǎn)量損失總和 4。由于環(huán)境污染導(dǎo)致可利 用水資源大大減少， 干旱現(xiàn)象日益嚴重。 因此，研究干旱脅迫對小麥的生理生化 指標的影響，提高小麥的抗旱性能、提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。1 材料與方法：1.1 實驗材料： 小麥種子和玉米種子 材料處理：小麥和玉米種子吸脹 12h 后即可用于測定種子發(fā)芽率的實驗。 選取長勢一致的小麥幼苗做干旱 5 天處理。干旱脅迫下處理的小麥幼苗為實驗組，正常培養(yǎng)的小麥幼苗為對照組。實驗試劑：TTC、曙紅染液、0.1% HgCI、蒸餾水、3%

4、磺基水楊酸（SSA）、石英砂、 冰乙酸、茚三酮、0.1% TCA、0.5% TBA、20% 三氯乙酸（TCA）、0.3% TCA 用 20% TC 配制、0.1 %Ti（SO4）2用 20% （v/v）H2SO4配制、50 mmol/L PBS（PH=6.0, 內(nèi)含 0.1 mmol/L EDTA, 1%PVP）、POD 反應(yīng)混合液（10 mmol/L 愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）、PPO反應(yīng)混合液（20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS 溶解）、3% 三氯乙酸（TCA）、1M NaOH、2 mM DTNB、5%三氯乙酸（TCA）、 0.15 M NaH2PO4 （pH=

5、7.4）、44%磷酸和 4%聯(lián)吡啶、3%FeCb、實驗儀器：研缽、試管、電子天平、移液管、洗耳球、722型分光光度計、離心機、微量加樣器、恒溫水浴鍋。1 .2實驗方法：1 .2. 1種子發(fā)芽率的測定：各取 50 粒吸脹的玉米種子或小麥種子,沿胚的中心線切成兩半（嚴格區(qū)分 兩個半粒），進行下列實驗：其中50個半粒進行TTC染色（30E水浴20min）; 另50個半粒進行曙紅染色（室溫染色 10 min） ,洗凈后觀察。根據(jù)兩種方法的染 色情況，分別計算發(fā)芽率。脯氨酸（Pro）含量的測定：提取：分別取0.1 g實驗組和對照組的幼苗一加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA） 和少許石英砂充分研磨用2

6、mL 3% SSA洗研缽5000rpm離心10 min 量上清液體積。測定：上清液各 2 mL 分別加入 2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮試劑煮沸 15 min 冷卻后5000 rpm離心10 min （若沒沉淀可略此步驟）分別測定 A520。計算：Pro content =A520L WV (umol.g -1FW)V用丙二醛（MDA ）含量的測定：提取：分別取0.1 g實驗組和對照組一加入3 mL 0.1% TCA和少許石英砂- 充分研磨用2 mL 0.1%TCA洗研缽5000 rpm離心10 min -量上 清液體積。測定：分別取上清液各1 mL 一加入0.5%TBA （用20%TC

7、A配制）3 mL 煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心5 min （視沉淀有無）分別 測定 OD450 和 OD532。計算：OD450=C1 >85.4OD532= C1 >7.4+155000 C2求解方程得：C1/ (mmol/L) =11.71 OD450C2/ （ mol/L） =6.45 OD532- 0.56OD450式中，C1為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度。過氧化氫（H2O2）含量測定：提?。悍謩e取0.1 g實驗組和對照組加入3 mL 0.3%三氯乙酸（TCA ）和 少許石英砂充分研磨用2 mL TCA洗研缽5000 rpm離心10 min 量上清液體積

8、。測定：分別取上清液各4 mL 加入0.1%Ti（SO4）2 用20%（v/v） H2SO4配制0. 2 mL搖勻OD410。計算:H?Q content =A410V顯 也 (umol.g -1 FW)L WV用抗氧化酶活性的測定:提取：分別取0.1 g實驗材料加入少許石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS,pH6.0,內(nèi)含0. 1 mmol/ LEDTA, 1%PVP ） 充分研磨 轉(zhuǎn)入離心管 中用2 ml提取液洗研缽5000 rpm離心10 min -量上清液體積 用于測定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80C保存。POD測定：取POD反應(yīng)混合液（10 mmol/L愈

9、創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2, 用PBS溶解）2.95 ml,加入酶液50 ml（空白調(diào)零用提取液取代）, 立即記時，搖勻，讀出反應(yīng) 2 min時的A470。PPO測定：取PPO反應(yīng)混合液（20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9 ml, 加入酶液0.1 ml （空白調(diào)零用提取液取代），立即記時，搖勻，讀 出反應(yīng)2 min時的A410。計算：以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個活力單位（U），則:POD activities =A470W t也(umol.gFWmin1)A410PPO activities =0.01 W t V用(U.g-1FW)谷胱甘肽（GSH）的

10、含量測定:提取:分別取0.1 g實驗組和對照組的幼苗加入3 mL 3%三氯乙酸（TCA） 和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% TCA洗研缽5000 rpm離心 10 min 量上清液體積。測定:上清液各2 mL （空白用3%三氯乙酸代替）分別加入0.4 mL1MNaOH 1 mL 2 mM DTNB 25 C 5 min 測定 A412計算:GSH content =A412 V顯 V (umol.g -1FW)2結(jié)果分析:表一曙紅染色、TTC法測定小麥種子發(fā)芽率曙紅染色TTC染色成活粒數(shù)（個）4746總數(shù)（個）5050成活率94 %92 %表二曙紅染色、TTC法測定玉米種子發(fā)芽率曙紅染色T

11、TC染色成活粒數(shù)（個）4845總數(shù)（個）5050成活率96 %90 %表三干旱脅迫和正常條件下小麥的各項生理指標條件Pro含量MDA 含量H2O2含量POD含量PPO含量GSH含量(mol.g-1FW)(mol/L)(mol.g-1 FW)(mol.g-1FWmin-1)(U.g-1FW)(mol.g-1 FW)干旱0.100.590.4884.67175415.34正常0.010.210.0935.7313045.722.1種子發(fā)芽率的測定：由表一、表二可知玉米和小麥的發(fā)芽率都達到了90%以上，發(fā)芽率比較高2.2脯氨酸（Pro）含量的測定:0.120.10.080.060.040.02Pro

12、含量0.10.01圖一 Pro含量由表三和圖一中可得出，在干旱脅迫下小麥的脯氨酸含量顯著增加。2.3丙二醛（MDA ）含量的測定:加。圖二MDA含量2.4過氧化氫（H2O2）含量測定:0.6H2O含 量0.50.40.30.20.1I干旱_）正常圖三H2O2含量由表三和圖三中可得出，在干旱脅迫下，小麥細胞中H2O2的含量顯著增加,2.5抗氧化酶活性的測定:的測定:PO活性圖四POD含量-I干旱廠正常2.5.2 PPO的測定:PPO活性I干旱両正常圖五PPO含量由表三和圖五中可得出，在干旱脅迫下，小麥細胞中 PPO的含量有所增加。2.6谷胱甘肽（GSH）的含量測定:15.34-5.72-GS含量

13、18161412108642二干旱正常圖六GSH含量3 討論：脯氨酸是植物細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)， 在逆境條件下， 脯氨酸會主動積 累，引起細胞滲透勢下降， 從而提高細胞的吸水能力或阻止水分外滲， 有助于細 胞和組織的持水，避免細胞過度失水 5 。實驗結(jié)果顯示，在干旱脅迫下小麥細 胞通過增加脯氨酸的含量， 使細胞的滲透勢降低， 阻止水分喪失， 使自身新陳代 謝能夠正常進行。是小麥抗干旱脅迫的一種機制。在逆境脅迫條件下，植物往往發(fā)生膜脂過氧化作用， MDA 是膜脂過氧化產(chǎn) 物之一，其含量的高低可反應(yīng)逆境脅迫下植物傷害程度的大小， 是膜脂過氧化程 度的重要標志 6 。實驗結(jié)果顯示，干旱脅迫下的小

14、麥 MDA 含量升高，證明干 旱脅迫下小麥細胞的膜脂過氧化程度還是較高的。植物在干旱時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強而使 H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直 接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸， 蛋白質(zhì)等生物大分子， 并使細胞膜遭受損害， 從而 加速細胞的衰老和解體7。實驗中干旱脅迫下的小麥 H2O2含量升高，證明干旱 脅迫對小麥細胞的還是有所傷害的。在 POD 生理功能中 ,多數(shù)是與某種或多種脅迫作用導(dǎo)致細胞膜的損傷和破 壞、細胞的空間結(jié)構(gòu)被打破以及損傷信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生理生化變化有關(guān) 8。 已知在干旱脅迫下，小麥細胞中H2O2的含量顯著增加，而H2O2的增加對小麥細 胞是有害的。POD是植物體內(nèi)擔負清除H

15、2O2的主要酶類之一，POD能催化H2O2 氧化其他底物后產(chǎn)生H2O9。在干旱脅迫下，POD的含量的增加也是小麥抗逆境 的一種機制。多酚氧化酶（PPO）是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶10。在植物的呼 吸作用中 ,呼吸鏈的末端氧化酶是直接把呼吸底物的中間產(chǎn)物氧化時脫出的電子 傳遞給O2的氧化酶,PPO是其中之一 11。PPO和POD同屬抗氧化酶，二者在逆 境中共同起到抗氧化的功能。谷胱甘肽（GSH）是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑， 可以清除細胞代謝過程 中產(chǎn)生的多余活性氧自由基， 減少由于膜脂過氧化作用而對細胞造成的傷害， 在 植物抵抗逆境脅迫中起著非常重要的作用 12。生物體內(nèi)不同的脅迫響

16、應(yīng)途徑中， 利用 GSH 的親核活性來消除活性氧和重金屬等對細胞的傷害。 因此，在生物的 氧代謝及抗逆生理中 GSH 發(fā)揮著重要的作用 13。干旱作為一種生物逆境脅迫， 一定會對小麥造成影響。 干旱會改變小麥生理 生化指標，從而影響植物的生長。經(jīng)過本次實驗可得知，在干旱脅迫下，小麥的 脯氨酸、丙二醛、H2O2、抗氧化酶、谷胱甘肽的含量均比正常條件下高。當小 麥受到干旱脅迫時， 小麥為了對抗干旱作用， 產(chǎn)生了一套應(yīng)對干旱脅迫的抗逆機 制。以降低干旱脅迫對植物正常生命活動的影響。4 參考文獻：1 葛培, 郭廣芳, 晏月明. 小麥抗旱機理研究進展 J. 生物技術(shù)通報 , 2010, (4): 22-

17、27.2 張林剛，鄧西平小麥抗旱性生理生化研究進展 J 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究 , 2000,18(3): 87-91.3 Jingjuan Z, et al. Water deficits in wheat : fmcmn exohydrolase (1 FEH) mRNA expression and relationship to soluble carbohydrate concentrations in two varietiesNew Phytologist，2009, 181: 843-850.4 王可玢,許春輝，趙福洪，等水分脅迫對小麥旗葉某些體內(nèi)葉綠素A熒光參數(shù)的影響明 J 生物物

18、理學(xué)報 , 1997,13(2): 273-278.5 高建社, 王軍, 周永學(xué), 等. 5 個楊樹無性系抗旱性研究 J. 西北農(nóng)林科技大 學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005, 33(2): 112-116.6 王愛國 , 邵從本 , 羅廣華 . 丙二醛作為脂質(zhì)過氧化指標的探討 J. 植物生理 通訊, 1986, (2): 55-57.7 吳強, 馮漢青 , 李紅玉 , 等. 干旱脅迫對小麥幼苗抗氰呼吸和活性氧代謝的 影響J.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報,2006, 32 (22) 17-224.8 覃鵬，劉葉菊，劉飛虎.干旱處理對煙草葉片SO刖POD舌性的影響A.中 國煙草科學(xué) , 2005, (2): 28-30.9 梁新華, 史大剛 . 干旱脅迫對光果甘草幼苗根系 MDA 含量及保護酶 POD、 CAT 舌性的影響 A. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究 , 2006, 24(3): 108-110.10 李廣酶，唐順連，商振清，等.滲透脅迫對玉米幼苗保護酶系統(tǒng)的影響J.河 北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1994， 17(2): 1- 5.11 段云青,王 艷,雷煥貴鎘脅迫對小白菜POD、PPO