普通PCR及測(cè)序PCR原理

1、一一 PCR技術(shù)技術(shù)什么是什么是PCR? 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)簡(jiǎn)稱技術(shù)，是一種在DNA聚合酶作用下體外擴(kuò)增特異片段的技術(shù)。 PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便，可在短時(shí)間獲得數(shù)百萬個(gè)特異的目的序列的拷貝。80年代中期PCR技術(shù)的發(fā)明，引起了生物技術(shù)發(fā)展的一次革命，目前已被廣泛應(yīng)用于與分子生物學(xué)相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。PCR反應(yīng)的幾個(gè)要素反應(yīng)的幾個(gè)要素 DNA聚合酶聚合酶 生產(chǎn)機(jī)器生產(chǎn)機(jī)器 模板（要擴(kuò)增的模板（要擴(kuò)增的DNA） 引物引物 dNTPs 原料原料 Buffer（緩沖液）（緩沖液） 穩(wěn)定的環(huán)境穩(wěn)定的環(huán)境 Mg 2+ 等等 潤(rùn)滑劑潤(rùn)滑劑模具模具PCR反應(yīng)步驟反應(yīng)步

2、驟模板DNA95變性變性(denaturaion)50引物1引物2DNA引物退火退火(annealing)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延伸延伸(extension)第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA（1）第1輪擴(kuò)增（2）第2輪擴(kuò)增（4）第3輪擴(kuò)增（8）第4輪擴(kuò)增（16）第5輪擴(kuò)增（32=232=25 5）標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L上下游引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L DNA聚合酶的主要活

3、性是在具備模板、引物、聚合酶的主要活性是在具備模板、引物、dNTP等等存在的情況下催化存在的情況下催化DNA的合成。的合成。Taq酶來自水生嗜熱菌酶來自水生嗜熱菌 Thermus aquaticus特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.良好的耐熱性良好的耐熱性 在在7080具有最高聚合活性具有最高聚合活性 在在95 仍然可以有仍然可以有50%活性活性 2. Mg2+依賴性依賴性 3. 擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增時(shí)3末端凸出一個(gè)末端凸出一個(gè)A 堿基堿基 3. 無校正功能無校正功能3 （6 6）緩沖液（）緩沖液（BufferBuffer） 10mmol/L TrisHCl 調(diào)節(jié)PH，使Taq酶活性作用環(huán)境維持在扁堿性（pH8.3,室溫

4、） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但過高會(huì)抑制Taq酶活性 0.01% 明膠 保護(hù)酶不變性失活 一個(gè)典型PCR體系反應(yīng)體系（50 ul）：Taq酶 2.5 U 10 x Buffer 5 uldNTP(2.5mM) 4 ulDNA模板 0. .12ug上游引物(10P) 2 ul下游引物(10P) 2 ul H2O 補(bǔ)足至50 ul總計(jì) 50 ul反應(yīng)流程（以擴(kuò)增片段大小為800bp為例）： 95 5 min 95 30 s 55 30 s 72 1 min 72 5 min 4 -30個(gè)循環(huán)PCR的特點(diǎn)特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將

5、皮克(pg=10 - 12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(g=10 -6)水平簡(jiǎn)便、快速簡(jiǎn)便、快速 PCR反應(yīng)一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè) 假陰性，無擴(kuò)增產(chǎn)物 非特異性擴(kuò)增 拖尾 假陽性 無擴(kuò)增產(chǎn)物模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer對(duì)樣品不合適對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降

6、解解反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時(shí)間太短伸時(shí)間太短 原原因因?qū)?duì)策策純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更換更換BufferBuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物管新引物降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無正對(duì)照有條帶，而樣品則無； 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：PCRPCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或

7、小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶?；蛐?，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)?duì)策策重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式式PCRPCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴(kuò)增 拖尾 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)狀態(tài)。

8、M 1 2模板不純模板不純BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)?duì)策策純化模板純化模板更換更換BufferBuffer適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適量用酶適當(dāng)降低適當(dāng)降低dNTPdNTP和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況) ) 原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止

9、將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。 （一）防止污染（一）防止污染試劑小量分裝試劑小量分裝吸頭及吸頭及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對(duì)照（二）設(shè)立對(duì)照陽性對(duì)照：陽性對(duì)照： 陽性模板陽性模板陰性對(duì)照：陰性對(duì)照： 陰性

10、模板陰性模板試劑對(duì)照：試劑對(duì)照： 除模板外的所有組分除模板外的所有組分注意的事項(xiàng)注意的事項(xiàng)：PCR的類型及應(yīng)用 研究 基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變 診斷 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷 人類基因組工程 遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 法醫(yī) 犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析 腫瘤 各種腫瘤檢測(cè) 其他PCR的不同類型的不同類型重組重組PCR 不對(duì)稱不對(duì)稱PCR 反向反向PCR 多重多重PCR原位原位PCR 連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng)巢式巢式PCR 遞減遞減PCR熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR RTPCR 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR55 固定組織或細(xì)胞固定組織或細(xì)胞: :將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛

11、處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K K消化處理消化處理: :用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增: :在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.雜交雜交: :PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交 人類染色體端粒人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片的熒光原位雜交照片 LCRLCR連接酶鏈反應(yīng)連接酶鏈反應(yīng) LCR （Ligase chain reaction）基本原理為利用DNA連接酶.特

12、異地將雙鏈DNA片段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增. 若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物. LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長(zhǎng)度為2026個(gè)，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識(shí)別單核苷酸錯(cuò)配的特異性極高.LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個(gè)溫度循環(huán)，94min變性和65復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右. 目前該方法主要用點(diǎn)突變的研究

13、與檢測(cè)、微生物病原體的檢測(cè)及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究等. 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗟氖褂媒档土藬U(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。套引物都互補(bǔ)的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的靈敏度，的靈敏度，并且提高了困難并且提高了困難PCR（如如5 RACE）的特異性。）的特異性。 遞減遞減PCRPCR（TouchDown PCRTouchD

14、own PCR） 遞減遞減PCR通過在通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的TmTm高大約高大約5的退火溫度下開始，的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低然后每個(gè)循環(huán)降低1 1-2 2, ,直到退火溫度低于直到退火溫度低于Tm Tm 5。 特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。 遞減遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如法更為有用，

15、如AFLP、DNA指紋分析等。指紋分析等。熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR PCR （HotStart PCRHotStart PCR） 熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，合成，直到直到PCR 儀達(dá)到變性溫度；儀達(dá)到變性溫度； 現(xiàn)在有很多公司都有現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用； 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異特異性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。RT-PCRRNARNA

16、的多聚酶反應(yīng)（的多聚酶反應(yīng)（RT-PCRRT-PCR）是以）是以RNA RNA 為模板，為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（r reverse everse t transcriptionranscription，RTRT）與與PCRPCR，可用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于，可用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于1010個(gè)拷貝的個(gè)拷貝的RNARNA模板模板。RNARNA擴(kuò)增步驟：擴(kuò)增步驟：在在單引物單引物的介導(dǎo)下和的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成的催化下，合成RNARNA的互補(bǔ)的互補(bǔ)cDNAcDNA加熱后加熱后cDNAcDNA與與RNARNA鏈解離，然后與另一引物退火，鏈解離，然后與

17、另一引物退火，并由并由DNADNA聚合酶聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶催化引物延伸生成雙鏈靶DNADNA最后擴(kuò)增靶最后擴(kuò)增靶DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶RNARNA雜合雙鏈雜合雙鏈PCR擴(kuò)增RNAcDNA反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶：禽類成髓細(xì)胞病毒禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶，活性包括依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶，活性包括依賴于RNA的的DNA合成，依賴于合成，依賴于DNA的的 DNA合成以及對(duì)合成以及對(duì)DNA:RNA雜交體雜交體的的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶酶H活性活性)。鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶。 MLV反轉(zhuǎn)錄酶兼?zhèn)湟蕾囉诜崔D(zhuǎn)錄酶兼?zhèn)湟蕾囉?/p>

18、RNA和依賴于和依賴于DNA的的DNA合成活性，但降解合成活性，但降解RNADNA雜交體雜交體中的中的RNA的能力較弱。的能力較弱。1.普通逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度為普通逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度為37-42度，所以反轉(zhuǎn)錄的延伸溫度一度，所以反轉(zhuǎn)錄的延伸溫度一般都是般都是37或或42 。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的一般步驟逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的一般步驟RNA模板模板+反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄引物，70，5min, 冰浴冰浴1min。再加以下反應(yīng)組分：再加以下反應(yīng)組分： Buffer dNTP 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶以上組分加好后，混勻，以上組分加好后，混勻，42或或37 60min。70，5min 后再冰浴，所得產(chǎn)物就

19、是后再冰浴，所得產(chǎn)物就是cDNA， cDNA用做后面的用做后面的PCR的模板。的模板。 一步法：一步法： 利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、酶、4種種dNTP 直接進(jìn)行直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而擴(kuò)增，從而使使mRNA的的PCR步驟更為簡(jiǎn)化。所需樣品量減少到

20、最低限度，臨床步驟更為簡(jiǎn)化。所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測(cè)非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測(cè)出總小樣品的檢測(cè)非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測(cè)出總RNA中小于中小于1ng的低豐度的低豐度mRNA。該法可用于低豐度。該法可用于低豐度mRNA的的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及文庫(kù)的構(gòu)建及特異特異cDNA的克隆，并有可能與的克隆，并有可能與Taq酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在單管中進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在單管中進(jìn)行。兩步法：兩步法：由于單管反應(yīng)時(shí)由于單管反應(yīng)時(shí)RT和和PCR都不能在最佳條件下進(jìn)行并且都不能在最佳條件下進(jìn)行并且

21、容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量因，及定量PCR。兩步法則是將。兩步法則是將RT和和PCR分別進(jìn)行，這分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。二二 、測(cè)序原理、測(cè)序原理 雙脫氧核苷酸終止測(cè)序法（也叫sanger測(cè)序法）的原理是：在PCR體系中加入雙脫氧核苷酸（ddNTP）， 在PCR延伸過程中ddNTP隨機(jī)

22、摻入到合成鏈中從而導(dǎo)致延伸的終止，經(jīng)過大量的這樣隨機(jī)終止的PCR反應(yīng)，生成一系列長(zhǎng)度相差1個(gè)堿基的PCR產(chǎn)物混合物，此產(chǎn)物通過電泳根據(jù)不同長(zhǎng)度片段的電泳速度不同來檢測(cè)整段DNA的序列。dNTP與與ddNTP雙脫氧終止法示意O堿基堿基CPOHH12345OHO堿基堿基CPOHH12345雙脫氧終止法示意脫氧核苷酸脫氧核苷酸（dNTP）的連接的連接O堿基堿基CPOHH12345OHO堿基堿基CPOH12345HDNA聚合酶聚合酶雙脫氧終止法示意脫氧核苷酸（脫氧核苷酸（dNTP）的連接）的連接O堿基堿基CPH12345HDNA聚合酶聚合酶雙脫氧終止法示意O堿基堿基CPOHH12345OH雙脫氧核苷酸（雙脫氧核苷酸（ddNTP）雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)組分 模板預(yù)備測(cè)序