Western blot

1、Western blot一、Western blot歷史及原理蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，簡稱WB。1975年，繼Edwin Southern發(fā)明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事發(fā)明的“Northern Blot”技術(shù)之后，受以上兩個“轉(zhuǎn)印”技術(shù)的啟示，1981年“Western Blot”這一技術(shù)正式問世?？贵w技術(shù)的發(fā)展，電泳及轉(zhuǎn)膜技術(shù)的改進使得Western Blot操作日益簡單；分析方法及工具多樣化、成像技術(shù)的革新、高靈敏度示標信號的出現(xiàn)使得Western Blot的檢測范圍得到擴

2、展，定量/半定量成為可能。目前Western Blot設(shè)備不斷更新、技術(shù)不斷發(fā)展，WB仍將在較長時間和應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)得到更加廣泛的應(yīng)用，其檢測靈敏度也將不斷提高。其基本原理與ELISA相似：通過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離混合蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)印到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜、尼龍膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以轉(zhuǎn)印到固相載體上的蛋白質(zhì)（多肽）作為抗原，與對應(yīng)的抗體（又稱一抗）特異性結(jié)合，特異性抗體再與酶、熒光素或同位素標記的抗一抗抗體（又稱二抗）起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測樣品中特異性蛋白（見圖1）。一抗的質(zhì)量是WB成功的關(guān)鍵，現(xiàn)在市面上抗體公司很多，一般選擇大公司大品牌

3、的抗體對于實驗的成功很有保證。但是由于實驗經(jīng)費的限制只能選擇小公司或國產(chǎn)二線品牌的抗體，這個時候需要使用者盡可能多考究：完整的質(zhì)檢數(shù)據(jù)；售后承諾；技術(shù)人員對產(chǎn)品的熟悉程度。對于二抗來說，選擇就更需謹慎，雖然二抗看似簡單，其質(zhì)量卻千差萬別，對實驗結(jié)果的影響也尤為重要。福因德科技（Frdbio）專注于免疫檢測產(chǎn)品的開發(fā)和工藝研究，只做精品；如果客戶購買的產(chǎn)品質(zhì)量達不到標明的水平，無條件退貨。對于WB的底物是根據(jù)二抗的標記酶來確定的，有大家較為熟悉的辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡

4、萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、半乳糖苷酶-Galactosidase，不同的酶對應(yīng)的底物當(dāng)然也不同，并且底物被催化后應(yīng)該是不擴散不溶解的圖1.Western blot 原理示意圖Western blot的主要流程如下：樣品制備 總蛋白質(zhì)的定量 SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗孵育 二抗孵育 加底物，顯色/顯影，定影/化學(xué)發(fā)光，下面將對這些步驟詳細介紹。二、Western blot操作流程在熟悉原理之后實驗人員可以根據(jù)操作流程輕松開展實驗，下面主要介紹關(guān)于Western blot的主要操作流程。 樣品制備： 動物細胞總蛋白的提?。杭毎己幸粋€保護細胞不受外界環(huán)境干擾的細胞

5、質(zhì)膜，細胞質(zhì)膜主要由磷-脂雙分子層組成。兩性的脂質(zhì)形成的等離子體膜在具有親水基團的同時也含有疏水性基團，從而自發(fā)的形成一個封閉的雙分子層壁。膜蛋白嵌入在脂質(zhì)雙分子層,橫跨疏水區(qū)，也就是說細胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，但其各成分的比例則是隨細胞類型及生物種屬的不同而對應(yīng)變化。實驗中提取細胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性劑如Triton-100、NP-40、SDS等，能夠插入并破壞細胞膜的磷脂雙分子層，從而達到細胞裂解的目的。這一類裂解液商品化的有很多，比如福因德科技研制的Western及IP細胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.W

6、BR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0104）等。在蛋白提取過程中盡量冰上操作以防止蛋白降解，也可適量加入蛋白酶抑制劑PMSF，福因德科技(Frdbio)可提供效果較好的蛋白酶抑制劑（Frdbio,Cat No.WBR0114）。對于加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除收集貼壁細胞外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細胞。 細菌及植物組織總蛋白的提?。簩τ趧游锛毎麃碚f質(zhì)膜是其唯一的保護屏障，但是在植物細胞和細菌的質(zhì)膜外還有一層堅硬的細胞壁存在。細菌的細胞壁主要由肽聚糖組成，由n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞酸兩種氨基糖經(jīng)-1.4糖苷鍵連接間隔

7、排列形成的多糖支架。而溶菌酶可以水解這一糖苷鍵從而達到裂解細胞的目的。對于細菌的裂解可以用含有一定濃度溶菌酶的PBS緩沖液（TE,pH8.0）即可。而植物細胞壁主要由纖維素和果膠組成的，這為植物細胞賦予了細胞形狀和剛度。對于植物組織蛋白的提取目前多用機械破壞法如液氮研磨或化學(xué)法如三氯醋酸-丙酮沉淀法或TCA丙酮沉淀法； 對于需要提取特殊亞細胞結(jié)構(gòu)的蛋白如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白、細胞膜蛋白等，由于操作比較麻煩，可以選用商業(yè)化的試劑盒，例如福因德科技(Frdbio)研制的核蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0106）與線粒體蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.W

8、BR0109）、細胞漿蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0108）。 總蛋白質(zhì)的定量：提取樣品的總蛋白后需要對提取的蛋白作定量分析，以便于電泳時上樣量的把握。目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法（Frdbio,Cat No.WBR0202）、沉淀法、Bradford法（Frdbio,Cat No.WBR0204）等，任何定量都需要選一個標準蛋白作為定量依據(jù)，繪制標準曲線，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。 制作標準曲線一般選用BSA來制作標準曲線，作為定量標準用的BSA（Frdbio,Cat No.WBR0205），其純度和理化性質(zhì)必須相當(dāng)?shù)臉藴?。配制一定濃度的B

9、SA標準溶液，按需求進行梯度稀釋，然后根據(jù)各種定量方法測定器數(shù)值，繪制標準曲線。福因德科技（Frdbio）有作為定量專用的BSA溶液提供（Frdbio, CatNo.WBE0205），商業(yè)化的蛋白定量測定試劑盒中都有標準BSA配置。 蛋白含量的測定蛋白含量測定的方法有多種，例如Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford法，但目前相對于另外兩個來說BCA法和Bradford法使用較多。在裂解細胞時使用的裂解液若是Western及IP細胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat

10、No.WBR0104）等，則可選用福因德科技（Frdbio）的BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（Frdbio,Cat No.WBR0202）、BCA蛋白定量試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）或Bradford蛋白濃度測定試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0204）搭配使用，但不同的試劑盒測定精確度不同，可根據(jù)實驗需要進行選擇，客戶可根據(jù)實際需要登陸我們網(wǎng)站查詢相關(guān)產(chǎn)品說明書。SDS-PAGE電泳 制樣上樣總體積一般不超過15l，上樣前將樣品與上樣緩沖液按要求混合后沸水中煮5 min使蛋白變性后立即冰浴。一般使用的是5×上樣緩沖液和2×上樣緩沖液，

11、5×上樣緩沖液的配置方法是：250mM Tris-HCl(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%(W/V)、0.5%(W/V)溴酚藍、50%(V/V)甘油、5%(W/V)-巰基乙醇。2×上樣緩沖液的則在5×的基礎(chǔ)上各含量減半。為節(jié)約科研工作者的時間和精力，可選擇福因德科技（Frdbio）的商品化上樣緩沖液，可選擇5×的蛋白上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304A）和2×的上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304B）。 制膠聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(

12、簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(APS)，N，N，N，N- 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)形成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）,沒有加變性劑如SDS，電泳過程中蛋白質(zhì)保持完整的天然狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素進行分離：蛋白大小，結(jié)構(gòu)和電荷；另外一種是變性聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）,在樣品和凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)被破壞，加入的SDS與蛋白結(jié)合后使得蛋白帶有很強的負電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，最終蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小和凝膠分子孔

13、徑排阻效應(yīng)。對于待檢蛋白活性有較高要求的實驗中，一般選用Native-PAGE，因為非變性膠在分離蛋白后對蛋白的活性并沒有明顯的影響，例如EMSA。一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時，要用低pH凝膠系統(tǒng)，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。分離酸性蛋白時候，要利用高pH（8.8）凝膠系統(tǒng)，蛋白會帶負電荷向陽極移動，SDS -PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，由濃縮膠（上層膠）和分離膠（下層膠）組成，當(dāng)電泳開始后，電泳開始時緩沖液中的氯離子泳動最快,甘氨酸根離子最慢，因此在中間形成低電導(dǎo)區(qū)，使蛋白聚集在移動界面附近,濃縮成一個狹窄的區(qū)帶。在進入

14、分離膠后蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動，從而達到分離蛋白的目的。蛋白分子量不同，所適用生物SDS-PAGE濃度也會對應(yīng)不同，下表是聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）和對應(yīng)的蛋白質(zhì)分離范圍（kD）聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）有效分離范圍（kD）65015083090102080121260151040配制的凝膠質(zhì)量對電泳條帶的清晰度以及背景有著密切的影響，灌膠前玻璃板一定要洗干凈并且用吸水紙擦干；灌膠時不能有氣泡；凝膠要徹底才能點樣電泳。另外制膠的藥品丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制膠過程中一定要小心，注意安全。現(xiàn)在為方便科研工

15、作者，已經(jīng)有商業(yè)化的SDS-PAGE凝膠試劑盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝膠試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0401）。 電泳當(dāng)樣品處在濃縮膠中時電壓不宜過高，可將電壓調(diào)在80V，在電泳大概30min左右，蛋白進入分離膠中，此時可稍微調(diào)高電壓至120V。電泳過程中由于系統(tǒng)會產(chǎn)熱，為得到較好的結(jié)果電壓不宜過高，但是為節(jié)約時間也不能太低，以上是經(jīng)過實驗總結(jié)出的較好的電壓選擇。為方便觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果以及判斷蛋白分子量大小，最好使用彩色預(yù)染蛋白分子量標準（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。蛋白遷移不僅與蛋白自身性質(zhì)以及PAGE凝膠有關(guān)，與電泳液也有

16、一定的關(guān)系。電泳液的離子強度，pH等都會影響蛋白的遷移。電泳液可以選擇使用福因德科技（Frdbio）生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液（Frdbio,Cat No.WBR0301）。 轉(zhuǎn)膜將凝膠分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛細管轉(zhuǎn)移法、熱對流轉(zhuǎn)移法、真空印跡轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法等，電轉(zhuǎn)移法由于其快速性及高效性一直備受科研工作者的青睞。轉(zhuǎn)膜的原理與電泳相同，蛋白與SDS結(jié)合形成復(fù)合體帶負電，在正負電場作用下，蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)印到膜上。由于膜對蛋白的吸附作用很強，同時由于甲醇的固定作用，所以轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白也不會輕易穿透膜“跑出去”，但是對于小分子量的蛋白質(zhì)還是很容易透過膜的孔

17、徑“穿透”出去。所以對于小分子量的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印時間不宜太長。轉(zhuǎn)膜儀的紅色代表正極，黑色代表負極，組裝時先把濕潤的海綿和濾紙依次鋪在負極上，再鋪上凝膠，隨后是膜，接著是濾紙和海綿，形成“三明治”結(jié)構(gòu)（見圖2）。注意在鋪凝膠和膜的時候一定要注意不能有氣泡，盡量用玻璃棒除掉所有氣泡。圖2.濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)半干轉(zhuǎn)的原理與濕轉(zhuǎn)是一樣的，是將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴酷。在電轉(zhuǎn)儀上鋪3層濕潤的濾紙，再將膜鋪在先鋪濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些轉(zhuǎn)移緩沖液到膜上；小心的將凝膠覆在

18、膠上，并做上記號；再在凝膠上鋪3層濾紙，注意的是此過程中要保證所有的夾層都是濕潤的，半干轉(zhuǎn)膜的夾層示意圖如下（圖2）。圖2. 半干轉(zhuǎn)膜的夾層示意圖電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜有可分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)：濕轉(zhuǎn)是一種比較傳統(tǒng)的方法，一般使用4預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，并且在4條件下進行。濕轉(zhuǎn)電流一般選擇在200400mA，時間為3090min，也可以1520mA轉(zhuǎn)膜過夜。片段>50kD的可以選用350mA，小片段的可以用250mA，具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽，因為電極板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法比較快。但是，半干轉(zhuǎn)移

19、法中濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路；另外半干轉(zhuǎn)過程中會大量產(chǎn)熱但是不好降溫，容易將膜烘干；且半干轉(zhuǎn)的效果不如濕轉(zhuǎn)的好，因此還是推薦大家使用濕轉(zhuǎn)的方式。轉(zhuǎn)膜的效率不僅跟蛋白在特定條件下與膜的結(jié)合能力也有關(guān)，另外還取決于凝膠的成分、凝膠與膜的接觸是否徹底、轉(zhuǎn)膜的時間，蛋白大小、蛋白組成以及電泳液。WB實驗中常用的膜有PVDF和NC膜，PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固；PVDF膜使用是需要甲醇預(yù)處理的，用目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結(jié)合。而NC膜的使用也很簡便，不需要預(yù)處理，只

20、要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了。不過NC膜比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途；而PVDF膜具有較高的機械強度，是印跡法中的理想固相支持物材料。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可以用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）或者氨基黑10B或印度墨水檢測轉(zhuǎn)膜效果，麗春紅染色液對膜進行染色不會干擾后續(xù)對膜的處理；也可以考染轉(zhuǎn)膜后的PAGE凝膠，檢查蛋白是否有殘留。 封閉從凝膠上轉(zhuǎn)印的蛋白不能把膜表面全部占據(jù)，因此需要封閉膜上剩余的位點防止抗體非特異性吸附，這就是封閉。最常用的封閉物質(zhì)是一些非相關(guān)蛋白，常見的有BSA、脫脂奶粉、各種動物血清、酪

21、蛋白；封閉緩沖液的對后續(xù)蛋白檢測的靈敏度、背景、信號強弱都有很大的影響。不同的抗原/抗體會適應(yīng)不同的封閉緩沖液，所以對于檢測效果不怎么理想的蛋白需要開展預(yù)實驗對其封閉緩沖液配方進行優(yōu)化。福因德科技（Frdbio）所用封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST(24.22g Tris、87.66g NaCl,加鹽酸調(diào)pH8.0，0.05%的Tween-20)。 洗滌同其他免疫檢測技術(shù)一樣，WB每一步的試劑孵育之后都要有一步洗滌，洗去游離的未結(jié)合的試劑、抗體，洗滌不充分會造成背景高，產(chǎn)生噪音信號，洗滌過度又會導(dǎo)致靈敏度降低，因此對于洗滌液的配方及洗滌時間的控制都需要優(yōu)化。通常用的洗滌液是含有Tris的TBS

22、或含有磷酸鹽的PBS緩沖液，為降低非特異性結(jié)合，一般會在洗滌液中加入終濃度0.05%的Tween-20。需要注意的是WB中使用的有些試劑如NP-40、Tween-20容易滋生微生物及真菌，而這些污染會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，因此在實驗過程中所用到的試劑都要新鮮配制，過濾除菌，4存放，一定要保證所用到的試劑都是無菌高純度的。福因德科技使用的洗滌液是TBST(0.05% Tween-20)。 一抗孵育WB主要是由一抗特異性識別膜上的目的蛋白或抗原決定簇，一抗的選擇主要依據(jù)于待檢抗原，需要注意的是并不是所有的一抗都適合于Western檢測的使用。一抗的稀釋度通常需要預(yù)實驗摸索條件，可以根據(jù)說明書上建議

23、的WB稀釋度附近做23個梯度，如果是用化學(xué)發(fā)光法檢測，由于其靈敏度高因此建議將稀釋度再降低25倍，甚至10倍。 二抗孵育二抗的選擇主要有三個原則：效價高；高效價的二抗對WB的結(jié)果很重要；效價高的二抗在使用時由于稀釋倍數(shù)高，自然非特異性吸附就低得多，背景也就低了。二抗效價高不但是二抗效價高，同時HRP標記的效率也要高。背景低，抗體的純度一定要高，高純度的抗體產(chǎn)生的非特異性背景較少。；質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)量穩(wěn)定是比較難以把握但是又必須保證的，這就需要在制備抗體抗體過程中所有操作都是可重復(fù)的，每一步都有嚴格的質(zhì)控，同時在穩(wěn)定劑和配方工藝上優(yōu)化，福因德科技（Frdbio）就是按此要求來工作的，研發(fā)出的抗體都是

24、高質(zhì)量且穩(wěn)定的抗體。在Western檢測過程中一抗對于靶蛋白的識別并不是通過直接的方法進行檢測的，一般標記的二抗才是檢測的直接對象。二抗的作用是放大信號，它是根據(jù)一抗而決定的，比如一抗來源于未免疫的小鼠，那么二抗必須是來源于小鼠之外的抗鼠IgG。另外，二抗的標記也要根據(jù)檢測方法選擇合適的標記，也就是二抗的標記與顯色方法是配套使用的。目前商品化的二抗種類很多，標記種類也有多樣供大家選用。比如HRP（辣根過氧化物酶）標記、AP（堿性磷酸酶）標記、Biotin（生物素）標記、等標記的二抗，其中福因德科技（Frdbio）已經(jīng)研究出70余種標記二抗。對于抗體的稀釋度從1:1001：500,000不等，母

25、液濃度一般為1mg/ml。不同的檢測系統(tǒng)對抗體的稀釋也會有不同的需求，當(dāng)然檢測靈敏度越高則抗體稀釋度越高，反之亦反。但是抗體的濃度最好不要太高，爭取有限的抗體可以得出漂亮的檢測結(jié)果，因為低濃度的抗體因為增強了親和的特異性而有利于降低背景。 底物顯色目前在WB檢測中最常用的酶是AP和HRP，鑒于HRP的物美價廉，高性能的卓越表現(xiàn)，使AP漸漸退出歷史舞臺。AP對應(yīng)的底物為BCIP/NBT，您可以選擇商品化的BCIP/NBT試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0601）。HRP對應(yīng)的底物很多，DAB、TMB、ECL等。與其他酶相比AP有一個獨特的優(yōu)勢是在高靈敏度時可較長時間顯色，但長時間顯色必

26、然帶來背景高的后果。以上所說的是通過酶化底物產(chǎn)物不溶性沉淀物來顯示信號并記錄信號的，被稱為WB第一代信號呈現(xiàn)技術(shù)；為了提高其靈敏度，科研工作者將魯米諾（ECL）作為HRP的底物，催化其發(fā)光，通過底片曝光、顯影、定影記錄信號，稱為WB第二代信號呈現(xiàn)技術(shù)，第二代信號呈現(xiàn)技術(shù)仍然是手工操作，需要暗房沖洗底片，人為控制影響因素很多，隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了WB第三代信號呈現(xiàn)技術(shù)：第三代信號呈現(xiàn)技術(shù)的底物和第二代相同，只不過其是通過儀器記錄信號的，其儀器核心元件為冷光CCD。第三代技術(shù)通過電子技術(shù)可以很容易控制曝光時間，得到效果較好的圖片，但是儀器成本太高，最便宜的價格都在10萬元以上?，F(xiàn)如今第一代信

27、號呈現(xiàn)技術(shù)已經(jīng)基本被淘汰，第二、三代呈現(xiàn)技術(shù)核心是魯米諾（ECL）化學(xué)發(fā)光底物，Pierce公司的Super-Signal系列化學(xué)發(fā)光液穩(wěn)定性好但是價格昂貴，福因德科技（Frdbio）在化學(xué)底物領(lǐng)域已掌握核心技術(shù)，其生產(chǎn)的ECL化學(xué)發(fā)光底物（Frdbio,Cat No.WBR0107）品質(zhì)與Pierce系列產(chǎn)品媲美。三、Western blot1.蛋白樣品提取（1）細胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液。2、每瓶細胞加3 ml ，4 預(yù)冷的Western及IP細胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）或RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.

28、WBR0103）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將裂解液棄凈，把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1 ml裂解液加10l PMSF (100 mM)（Frdbio,Cat No.WBR0114），搖勻置于冰上。4、每瓶細胞加400l含PMSF裂解液，于冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行)6、于4 下12000 rpm離心5 min。7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于-20 保存

29、。（2）組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊用干凈的剪刀盡量剪碎，并置于12 ml勻漿器球狀部位。2、加400l裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。3、重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30min后，可用移液器將裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）移至1.5 ml離心管中，然后在4 下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20 保存。（3）加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細胞脫落下來，所以除按(一)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細胞。培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提?。?#160;1

30、、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。2、棄上清，加入4 mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3、用槍吸干上清后，加100l裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）(含PMSF)冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4 、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20 保存。2.蛋白含量的測定用BCA蛋白定量試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）測定蛋白含量，如下

31、表：試劑管號12345空白管測定管蛋白質(zhì)標準液L (1 mg/mL)2040608010000ddH2O (L)8060402001000待測樣品 (L)000000100BCA工作液 (mL)2222222混勻，37 保溫30 min，用562 nm比色，測定吸光值測定結(jié)果3.SDSPAGE電泳 清洗玻璃板： 制樣點樣量一般為10l，根據(jù)樣品的濃度選擇合適的上樣緩沖液：若蛋白濃度較高，選擇2×的上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304B），將蛋白與上樣緩沖液按11的體積比混勻后，100煮樣5min；若蛋白濃度不是特別高則可選用5×的蛋白上樣緩沖液（Frdbi

32、o,Cat No.WBR0304A），將蛋白與上樣緩沖液按41的體積比混勻后，100煮樣5min即可。煮樣結(jié)束后立即取出冰浴，等待點樣。 制膠注意：一定要帶手套，因為其中的丙烯酰胺為神經(jīng)性致毒劑，對神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用；加入各成分后一定要混勻，否則可能會有局部凝固的現(xiàn)象；操作一定要快，防止提前凝固；下表是配制濃縮膠和對應(yīng)濃度的分離膠各成分的含量分離膠：（10ml） 不同濃度凝膠各成分體積 （ml）各組分名稱6%8%10%12%15%H2O5.34.64.03.32.330% Acrylamide2.02.73.34.05.01.0M Tris-HCl（pH8.8）2.52.52.52.52.51

33、0% SDS0.10.10.10.10.110%AP(過硫酸銨)0.10.10.10.10.1TENED0.0080.0060.0040.0040.004總體積1010101010濃縮膠：（5ml）各組分名稱體積(ml)H2O3.430% Acrylamide0.831.0M Tris-HCl（pH6.8）0.6310% SDS0.0510%AP(過硫酸銨)0.05TENED0.005為了方便客戶，減少客戶在配制丙烯酰胺凝膠過程中對人體傷害，福因德科技（Frdbio）推出了凝膠配制試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0401），為了更方便科研工作者，福因德科技（Frdbio）還推出了預(yù)制

34、膠供客戶選用。 上樣注意：點樣前需離心，取上清點樣；所有孔都點樣，所點樣品體積和量都差不多，重要樣品點中間一點，最兩邊不要點重要樣品；為了便于標識分子量，WB建議使用彩色預(yù)染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 電泳80 V電壓進行電泳，待溴酚藍至濃縮膠和分離膠分界處時，改電壓為120V繼續(xù)電泳，溴酚藍至膠底部1 cm左右時停止電泳，耗時大約90min。4.轉(zhuǎn)膜（以濕轉(zhuǎn)為例）（1）根據(jù)膠的尺寸準備相同大小的濾紙6張和PVDF或NC膜1張(一定要戴手套)。PVDF膜使用前需要用甲醇活化，NC膜使用時轉(zhuǎn)膜液中需要加20 %甲醇（轉(zhuǎn)膜液/甲醇體積比41）。（2）將夾子打開使

35、黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊三層濾紙，趕去其中的氣泡。（3）分離膠蓋于濾紙上與濾紙對齊，趕去氣泡。將膜蓋于膠上，在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一張海綿墊，合起夾子。（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾的黑面對槽的黑面（電源負極），白面對槽的紅面（電源正極）。根據(jù)目的蛋白分子量確定轉(zhuǎn)膜時間和電流。濕轉(zhuǎn)一般推薦設(shè)定電流為300400mA,轉(zhuǎn)膜時間為4060min。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大電流值300

36、mA，延長轉(zhuǎn)膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。另外，轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱比較厲害，最好是放在冰浴中進行。（6）轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考馬斯亮藍染PAGE膠，檢測轉(zhuǎn)膜效率。5.抗體孵育（1）標記轉(zhuǎn)印面后將膜移至含有封閉液（5%的脫脂奶粉溶解在TBST緩沖液中）的容器中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。（2）封閉完之后，用TBST洗滌12次，將一抗中用TBST按照說明書推薦比例進行稀釋，制備成一抗工作液，一般在12002000；將膜放入一抗工作液中，室溫下孵育12 h或4孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS

37、洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀釋1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀釋度都在13000以上；用TBS-T在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將ECL發(fā)光試劑盒的A液（配方：1.722g魯米諾用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）兩種試劑等體積混合，配成ECL化學(xué)發(fā)光工作液；將膜的轉(zhuǎn)印面與此混合液充分接觸；15 min后，吸盡殘液，覆膜，放入膠片夾中。（2）在暗室中，將顯影液和定影液分別倒入顯影定影缸中；在紅燈下取出膠片，剪裁適

38、當(dāng)大?。话涯z片放在膜上，關(guān)上膠片夾；根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間；曝光完成后，取出膠片，浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把膠片浸入定影液中，定影時間以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。（顯影液配方：750ml溫水（3045）、3.5g米吐爾、45g無水亞硫酸鈉、12g幾奴尼、45g無水碳酸鈣、2g溴化鉀，加冷水定容至1L；定影液配方：600ml 50的水、240g硫代硫酸鈉、15g無水亞硫酸鈉、48ml 28%的醋酸、7.5g硼酸、15g明礬加水定容至1L）福因德科技（Frdbio）有高品質(zhì)的顯/定影液可供客戶選用（Frdbio,Cat

39、No.WBR0801）。7.凝膠圖象分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值等。 上樣注意：點樣前需離心，取上清點樣；所有孔都點樣，所點樣品體積和量都差不多，重要樣品點中間一點，最兩邊不要點重要樣品；為了便于標識分子量，WB建議使用彩色預(yù)染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 電泳80 V電壓進行電泳，待溴酚藍至濃縮膠和分離膠分界處時，改電壓為120V繼續(xù)電泳，溴酚藍至膠底部1 cm左右時停止電泳，耗時大約90min。4.轉(zhuǎn)膜（以濕轉(zhuǎn)為例）（1）根據(jù)膠的尺寸準備相同大小的濾紙6張和PVDF或NC膜1張(一定要戴手套)。PVDF膜使用前

40、需要用甲醇活化，NC膜使用時轉(zhuǎn)膜液中需要加20 %甲醇（轉(zhuǎn)膜液/甲醇體積比41）。（2）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊三層濾紙，趕去其中的氣泡。（3）分離膠蓋于濾紙上與濾紙對齊，趕去氣泡。將膜蓋于膠上，在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一張海綿墊，合起夾子。（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾的黑面對槽的黑面（電源負極），白面對槽的紅面（電源正極）。根據(jù)目的蛋白分子量確定轉(zhuǎn)膜時間和電流。濕轉(zhuǎn)一般推薦設(shè)定電流為300400mA,轉(zhuǎn)膜時間為4060min。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間

41、越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大電流值300mA，延長轉(zhuǎn)膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。另外，轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱比較厲害，最好是放在冰浴中進行。（6）轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考馬斯亮藍染PAGE膠，檢測轉(zhuǎn)膜效率。5.抗體孵育（1）標記轉(zhuǎn)印面后將膜移至含有封閉液（5%的脫脂奶粉溶解在TBST緩沖液中）的容器中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。（2）封閉完之后，用TBST洗滌12次，將一抗中用TBST按照說明書推薦比例進行稀釋，制備成一抗工作液，一般在12002000；將膜放入一抗工作

42、液中，室溫下孵育12 h或4孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀釋1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀釋度都在13000以上；用TBS-T在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將ECL發(fā)光試劑盒的A液（配方：1.722g魯米諾用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）兩種試劑等體積混合，配成ECL化學(xué)發(fā)光工作液；將膜的轉(zhuǎn)印面與此混合液充分接觸；15 min后，吸盡殘液，覆膜，放入膠片夾中。（2）在暗室中，將顯影液和定影液分別倒入顯影定影缸中；在紅燈下取出膠片，剪