消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)

1、消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)第一篇壓力蒸汽滅菌效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)1主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評價滅菌效果的檢測方法。本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評價。2試齊1J本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說明規(guī)格者，均為分析純（ AR）,水為蒸儲水。2. 1 蛋白陳。2. 2葡萄糖。2. 3澳甲酚紫酒精溶液：取澳甲酚紫 2. 0g,溶于100mL95%乙醇中。2. 4澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基配制：蛋白陳 10. 0g,葡萄糖5. 0g,溶于1000mL蒸 儲水中，調(diào)pH值至7. 07. 2,然后再加2%澳甲酚紫酒精溶液0. 6mL,搖勻后，按5m L/管，分裝包口，置壓力蒸汽滅

2、菌器中，于 115c滅菌40min后備用。3指小菌嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC 7953或SSI K31）菌片，含菌量為5X1055M06cfu/片，1 21c下，殺滅90%微生物所需時間D121值為1. 31. 9min,殺滅時間（KT值）為0 19mi n,存活時間（ST值）為49min。4化學(xué)指示劑需用衛(wèi)生部批準(zhǔn)的化學(xué)指示劑。5技術(shù)要求壓力蒸汽滅菌器壓力，MPa/cm2溫度C火菌時間,min下排氣式0.070115400.10512130預(yù)真空式0.2101344-6國家技術(shù)監(jiān)督局1995-12-15批準(zhǔn)1996-07-01實施6檢測方法6 1生物學(xué)指標(biāo)（用作壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù)

3、）7 1 1 將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗包中心部位。8 1 2 滅菌柜室內(nèi)，上、中層中央和排氣口處各放置一個標(biāo)準(zhǔn)試驗包（由 3 件平紋長袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cmK 10cm、8層紗布敷 料包裹成25cmK30cnriX30cm大?。?。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒 （22cnriX 13cnriX6cm） 代替標(biāo)準(zhǔn)試驗包，盒內(nèi)盛滿中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內(nèi)（試管口用滅菌牛皮紙包封），將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。9 1 3 經(jīng)一個滅菌周期后，在無菌條件下，取出標(biāo)準(zhǔn)試驗包或通氣貯物盒中的指示菌片，投入

4、澳甲酚紫葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中，56c培養(yǎng)48h,觀察培養(yǎng)基顏色變化。10 2 化學(xué)指標(biāo)在物品包外用化學(xué)指示膠帶， 可作為物品是否經(jīng)過滅菌的處理標(biāo)志。 在物品包內(nèi)中心部 位用化學(xué)指示劑，可作為物品是否滅菌的參考標(biāo)志。7 結(jié)果判定及評價7 1 同次檢測中，標(biāo)準(zhǔn)試驗包或通氣貯物盒內(nèi)，每個指示菌片接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基全部不變色， 判定為滅菌合格。 指示菌片之一接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基由紫 色變?yōu)辄S色時，判定為滅菌不合格。11 2 化學(xué)指示劑的顏色變?yōu)榕c滅菌合格標(biāo)準(zhǔn)色相同時， 或熔化時作為滅菌合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。第二篇 紫外線表面消毒效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)12 主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了物體表

5、面消毒用紫外線的波長、 強(qiáng)度及評價其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)檢測方法。本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評價。13 指示菌14 1 大腸桿菌（ 8099 或 ATCC 25922）。15 2 枯草桿菌黑色變種芽胞（ ATCC 9372）。16 物理學(xué)指標(biāo)10. 1在電壓220V時，普通30W直管型紫外線燈，在室溫為2025c的使用情況下，253. 7nm紫外線輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)學(xué)70仙W/cm210. 2在電壓220V時，高強(qiáng)度紫外線燈，在室溫為2025C的使用情況下，253. 7n m紫外線輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)200仙W/cm210 3 照射劑量按式（ 1）計算：1

6、）劑量（aW s/cm2=強(qiáng)度（W/cm2刈寸問（s）11 檢測方法12 1 物理學(xué)檢測方法11. 1. 1燈管的紫外線強(qiáng)度（aW/cm2用中心波長為253. 7nm的紫外線強(qiáng)度測定 儀（標(biāo)定有效期內(nèi)），在燈管垂直位置1m 處測定。11 1 2 在實際應(yīng)用中消毒表面的照射強(qiáng)度應(yīng)以燈管與消毒對象的實際距離測定。11 1 3 表面消毒接受的照射劑量，應(yīng)達(dá)殺滅目標(biāo)微生物所需。對大腸桿菌，照射劑量應(yīng)達(dá)到20000仙VW- s/cm2對枯草桿菌黑色變種芽胞應(yīng)達(dá)到100000仙VW- s/cm211 2 生物學(xué)檢測方法11 2 1 采用載體定量消毒試驗。載體制備按本標(biāo)準(zhǔn)附錄 C 進(jìn)行。11 2 2 開啟紫

7、外線燈 5min 后，將 8 個染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當(dāng)距離照射，于4 個不同間隔時間各取出 2 個染菌玻片，分別投入2 個盛有 5mL 洗脫液（ 1吐溫 80， 1蛋白胨生理鹽水）試管中，振打 80 次。11 2 3 經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取0 5mL 洗脫液，作平板傾注，每個染菌玻片接種兩個，放37培養(yǎng)48h 作活菌計數(shù)。11 2 4 陽性對照，除不作照射處理外，取2 個染菌玻片分別投入 2 個盛有 5mL 洗脫液中振打80 次，余按 4 2 3 進(jìn)行。11 2 5 計算殺滅率12 判定標(biāo)準(zhǔn)12. 1對指示菌殺滅率99 9%判為消毒合格。12 2 達(dá)物理學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)時，作為消毒合格的參

8、考標(biāo)準(zhǔn)。第三篇 液體消毒劑消毒效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學(xué)檢測方法及其評價標(biāo)準(zhǔn)。本方法適用于消毒劑對各種物體的消毒效果評價。14 理化指標(biāo)將消毒劑置20 2水浴中，測定在使用濃度下殺滅指示微生物達(dá)到消毒或滅菌所需的最短時間（ min ）。15 指示微生物15 1 細(xì)菌15 1 1 細(xì)菌繁殖體：金黃色葡萄球菌（ ATCC 6538）、大腸桿菌（8099或 ATCC25922）。16 1 2 細(xì)菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞（ ATCC 9732）。17 2 真菌：白色念珠菌（ ATCC 10231）。18 3 乙型肝炎表面抗原：純化抗原（ 1 0mg/mL ）。16 檢測

9、方法16 1 中和試驗（見附錄 A ）。16 2消毒劑定性消毒試驗（見附錄B ）。16 3消毒劑定量消毒試驗（見附錄C）。16 4消毒劑殺菌能量試驗（見附錄D ）。19 5 乙型肝炎表面抗原（ HBsAg ）抗原性破壞試驗（見附錄 E）。20 消毒效果評價標(biāo)準(zhǔn)17. 1對細(xì)菌和真菌的殺滅率99 9%,對HBsAg,將檢測方法靈敏度104倍或5義104 倍（載體試驗）的 HBsAg 抗原性破壞，可判為消毒合格。17 2 對枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。17 3 在實際應(yīng)用中消毒效果評價以有機(jī)物保護(hù)試驗的最低濃度和最短時間為該消毒劑達(dá)到實用消毒所需的濃度和時間。附錄 A中和劑中和效

10、果試驗（補(bǔ)充件）A1 內(nèi)容提要為了準(zhǔn)確評價消毒劑對微生物的殺滅作用，消毒試驗中要求選擇適當(dāng)中和劑。所選中和劑不僅能及 時中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物（下稱中和產(chǎn)物）尚需對微生物無抑制或殺滅作用，對培養(yǎng)基無不良影響。A2 培養(yǎng)基和試劑A2 1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 00g牛肉膏3 00g氯化鈉5 00g瓊脂15 00g蒸餾水1000 00mL制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸儲水中，調(diào) pH至7. 27. 4,加入瓊脂后加熱溶解，過濾分裝，經(jīng) 121 、壓力蒸汽作用 30min ，滅菌后備用。A2. 2 0. 03mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7 . 27

11、. 6,下稱 PBS）。成分：磷酸氫二鈉2 84g磷酸二氫鉀1 36g蒸餾水1000 00mL制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸儲水中，pH為7. 27. 4,分裝，經(jīng)121 C、30min壓力蒸汽滅菌后備用。A3 器材A3 1 錐形燒瓶。A3 2 平皿（直徑9cm）。A3 3 量筒。A3 4 精密 pH 試紙。A3 5 無菌試管。A3 6 無菌刻度吸管（ 1 0， 5 0， 10 0mL）。A3 7 恒溫培養(yǎng)箱。A3 8 冰箱。A3 9 菌落計數(shù)器。A3 10 酒精燈。A4 中和劑（注明生產(chǎn)廠家，批號）A5 操作方法A5. 1 用PBS將指示菌制成 5X 1055X 106cfu/mL懸

12、液。A5 2 將消毒劑用滅菌蒸餾水配制成3 種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測知該消毒劑 10min抑殺指示菌99 9以上的最低有效濃度。A5 3 取消毒劑 10min 抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進(jìn)行試驗， 選出中和劑種類并依據(jù)等當(dāng)量中和原則，調(diào)整中和劑濃度，選出試驗濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。A5 4 中和劑選擇試驗時，先將消毒劑 1 0mL 與中和劑溶液9 0mL 混合，制成中和產(chǎn)物溶液， 再按表A1 分組進(jìn)行。表 A1 中和劑選擇試驗photo-2A6 中和試驗結(jié)果報告方法（如表A2 ）表 A2 中和試驗結(jié)果舉例photo-33、 4 、 5 組間誤差率計算公式A7 判定

13、標(biāo)準(zhǔn)A7. 13、4、5組菌數(shù)相似，其誤差率W10%。A7 2 6 組無菌生長。A7 3 2 組菌數(shù)明顯少于3、 4、 5 組。A7 4 1 組不長菌或明顯少于2 組。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的中和劑表明可消除消毒劑對指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對指示菌無毒害，判定為該消毒劑的中和劑。A8 消毒試驗用中和劑濃度的選擇按A5. 4步驟進(jìn)行，按 A7. 17. 4的標(biāo)準(zhǔn)判定。附錄 B消毒劑定性消毒試驗(補(bǔ)充件)B1 內(nèi)容提要定性消毒試驗是測定受消毒因子作用后的樣本有無細(xì)菌生長的試驗方法。用于對消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細(xì)菌效果的初步評價。B2 培養(yǎng)基與試劑B2 1 普通肉湯培養(yǎng)基B2 1

14、 1 成分：蛋白胨 10 00g氯化鈉 5 00g肉浸液1000 00mLB2 1 2 制法：取蛋白胨、氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 至弱堿性，煮沸、濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7. 27. 4,壓力蒸汽滅菌備用。B2 2 試劑82 . 2. 1 稀釋液：含 1%蛋白月東的 0. 03mol/L PBS (pH7. 27. 4)。B2 2 2 滅菌蒸餾水。83 2 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 選擇。84 1 滅菌刻度吸管（ 1 0， 5 0， 10 0mL）。B3 2 滅菌試管。B3 3 滅菌三角燒瓶。B3 4 酒精燈。B3 5 恒溫水浴箱。83 6 恒溫培養(yǎng)箱。84 試驗方法B4. 1

15、將菌液進(jìn)行活菌計數(shù)，并用稀釋液配制成含菌量為5X 1055X 106cfu/mL的菌懸液。B4 2 將滅菌試管10 支排列于試管架上，標(biāo)記管號。B4 3 每個試管加滅菌蒸餾水2 5mL ，放20 2 水浴中。B4 4 于第 1 管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液2 5mL ，混勻后取2 5mL 移入第 2 管，再次混勻，從第 2管中取 2 5mL 移入第 3 管，以此類推至第9 管，混勻后棄去2 5mL ，第 10管中不加消毒液作對照。84. 5加菌懸液2. 5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時間，使菌藥混合液中含菌量均為105106cfu/mL 。84 6 各管分別于加菌后4 個不同間隔時間，取出 0 5

16、mL ，加入 4 5mL 中和劑內(nèi)，中和10min后，取出 0 5mL 加入 4 5mL 營養(yǎng)肉湯管內(nèi)。B4 7 將接種細(xì)菌的肉湯管放37培養(yǎng)48h ，觀察初步結(jié)果，無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至第7 天。B4 8 試驗重復(fù) 5 次。B5 結(jié)果判定B5 1 若肉湯管混濁，則表示有菌生長，記為陽性，以（ + ）表示。B5 2 若培養(yǎng)至第7 天，肉湯管澄清，則表示無菌生長，記為陰性，以（）表示。85 3 對難以判定的肉湯管， 取 0 1mL 接種于營養(yǎng)瓊脂平板， 用滅菌 L 棒涂勻， 放 37培養(yǎng) 48h， 觀察菌落形態(tài)；并做涂片染色鏡檢，判斷是否有指示菌生長。有指示菌生長記為陽性。B5 4 5 次試驗，均

17、無指示菌生長表示達(dá)到滅菌。附錄 C消毒劑定量消毒試驗（補(bǔ)充件）C1 內(nèi)容提要定量消毒試驗是測定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數(shù)量的試驗方法，以殺滅率表示結(jié)果。用于對消毒劑殺滅效果的評價。C2 培養(yǎng)基與試劑C21普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按本標(biāo)準(zhǔn)A21制備。C22試劑C2.2.1稀釋液：含 1%蛋白月東的 0. 03mol/LPBS （pH7. 27. 4）。C22 2滅菌蒸餾水。C2 2 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 選擇。C2. 2. 4 0. 03mol/L PBS (pH7. 27. 4)。20 2水浴中。C2 2 5 洗脫液：含中和劑、 1蛋白胨、 0 1吐溫 80 的 PBS。C3器材C3

18、 1 滅菌刻度吸管（ 1 0， 5 0 ， 10 0mL ）。C32滅菌試管。C33滅菌三角燒瓶。C34滅菌平皿（直徑為 9cm）。C35恒溫水浴箱。C36恒溫培養(yǎng)箱。C37酒精燈。C38菌落計數(shù)器。C39微量進(jìn)樣器。C3. 10載體：根據(jù)需要及試驗?zāi)康倪x用經(jīng)脫脂處理0. 5cmX1. 0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片。C4 試驗方法C4 1 定量懸液試驗C4. 1. 1將菌液進(jìn)行活菌計數(shù)，并用稀釋液稀釋成含菌量為5X1055X 106cfu/mL的菌懸液。C4 1 2 將消毒劑用滅菌蒸餾水稀釋成3 個不同濃度，各吸取4 5mL 分別加入三個試管內(nèi)，放C4 1 3待

19、試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個試管中分別加入0 5mL 菌懸液（含菌量為5X 1055X106cfu/mL ）,混勻并開始記時。C4 1 4 分別于 4 個不同間隔時間，各取0 5mL 菌液混合液移入 4 5mL 中和劑中混勻。C4 1 5 中和10min ，作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行活菌計數(shù)。C4. 1. 6陽性對照以洗脫液代替消毒液，同時按 C4. 1. 2C4. 1. 5進(jìn)行。C4 1 7 按不同稀釋度推算出每個樣本存活菌數(shù)（ cfu/mL ），按式（ C1 ）計算殺滅率：C4 1 8 試驗重復(fù) 5 次。C4 2 載體定量試驗C4. 2. 1將滅菌載體平放于滅菌平皿內(nèi)，每個載體滴注定量菌液

20、（載體回收菌量達(dá)5X1055X106cfu/片），涂勻，放37c培養(yǎng)箱待干。應(yīng)用市售染菌載體時，回收菌量亦應(yīng)達(dá)5X 1055X106cfu/片）。C4 2 2 用滅菌蒸餾水將消毒劑稀釋成3 個不同濃度，各吸取5mL 分別加入三個試管內(nèi)，放20 2 水浴中。C4 2 3 待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用至規(guī)定時間，將染菌載體移入含中和劑的5mL洗脫液試管內(nèi)，中和10min,振打80次，適當(dāng)稀釋，接種兩個平板。放37c培養(yǎng)24 48h ，進(jìn)行活菌計數(shù)。C4. 2. 4陽性對照，以洗脫液代替消毒液按C4. 2. 2C4. 2. 3進(jìn)行。C5 結(jié)果判定C5. 1 5次試驗的殺滅率均

21、R 99. 9%判為消毒合格。C5 2 對枯草桿菌黑色變種芽胞5 次試驗均全部殺滅判為消毒合格。附錄 D有機(jī)物保護(hù)試驗（補(bǔ)充件）D1 內(nèi)容提要有機(jī)物保護(hù)試驗是測定消毒劑對有機(jī)物保護(hù)條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結(jié)果與該消毒劑定量消毒試驗相比較，用于評價有機(jī)物對消毒劑的殺菌能力的影響。D2 培養(yǎng)基與試劑D2 1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按本標(biāo)準(zhǔn)A2 1 制備。D2 2 試劑：D2 2 1 稀釋液：同 C2 2 1。D2 2 2 滅菌蒸餾水。D2 2 3中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A 進(jìn)行選擇。D2. 2. 4 0. 03mol/L 磷酸緩沖液（pH7 . 27. 4）（簡稱 PBS）。D2 2

22、 5 洗脫液：含1蛋白胨，0 1吐溫80 的生理鹽水。D2 2 6 小牛血清加入菌懸液中，使其最終濃度為 10。D3 器材C3。D4 試驗方法D4 1 實驗前預(yù)先將菌液進(jìn)行活菌計數(shù)， 用稀釋液稀釋， 加入小牛血清， 使其最終含血清量為 10 ，含菌數(shù)為5X 1055X 106cfu/mL ,以此作為試驗菌懸液。D4. 2 以下步驟同本標(biāo)準(zhǔn) C4. 1. 2C4. 1. 8。D5 結(jié)果判定D5 1 5 次試驗的殺滅率均大于 99 9 所需最低濃度和最短時間， 判為該消毒劑在有機(jī)物存在下，可以達(dá)到消毒的有效濃度和時間。D5 2 此有效濃度和時間與定量消毒試驗達(dá)到消毒的有效濃度和時間相同或相近， 判

23、為有機(jī)物對消毒劑殺菌作用無明顯影響。達(dá)到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時間延長一倍以上者可視為有明顯影響。附錄 E乙型肝炎表面抗原破壞試驗（補(bǔ)充件）E1 內(nèi)容提要乙型肝炎表面抗原（ HBsAg ）破壞試驗是以 HBsAg 的抗原活性為間接標(biāo)志，評價消毒因子對乙型肝炎病毒（ HBV ）滅活能力的試驗方法。適用于評價化學(xué)消毒劑、紫外線對HBV 的消毒效果。E2 試劑E2 1 小牛血清（ 56 ， 30min 滅活）。E2. 2 0. 01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7. 27. 4)。E2 3 純化 HBsAg （ 1 0mg/mL ）。E2. 4固相放射免疫分析法試劑，要求特

24、異性100%,精密性CVW15%,靈敏度V 1. 0ng/mL,線性 r0. 95。E2. 5 酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100%,精密性CVW15%,靈敏度w 3. 2ng/mL ,線性r0. 95。E3 器材E3. 1 吸量器：包括試管、吸管（0. 1, 1. 0, 5. 0和10. 0mL4種）和微量進(jìn)樣器（100. 0L）。E3 2 載體（直徑1 5cm 大小的不銹鋼片）。E3 3 免疫計數(shù)儀。E3 4 酶聯(lián)免疫測定儀。E3.5 低溫冰箱（一30c一70C）。E4 HBsAg 懸液的配制E4 1 取 0 01mol/LPBS （pH7 2c 7 4） 9 4mL 加入小牛血清0 6

25、mL ，配成含6小牛血清的懸液。再取該 PBS 9 0mL ，加入濃度為 1 0mg/mL 的純化 HBsAg 懸液 1 0mL ，使成含 5 4小牛血 清，HBsAg濃度為100g/mL的試驗用 HBsAg懸液。E4 2 將試驗用 HBsAg 懸液 1 0mL 盛裝入容量為 1 5mL 的玻璃安瓿中，封口，放 30c 70冰箱保存?zhèn)溆?。保存期為三個月。E5 HBsAg 的檢測方法E5 1 固相放射免疫分析法（ SPRIA ）。E5 2 酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）。E6 中和劑選擇在測定消毒劑對HBsAg 的破壞效果時，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行破壞試驗。所用中和劑：a 應(yīng)

26、能有效而及時中止消毒劑的殘余作用；b 中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對HBsAg的抗原活性沒有影響，亦不影響檢測方法對 HBsAg 檢出的靈敏度。E6 1 將消毒劑用無菌蒸餾水配成不同濃度，取1 2mL 消毒液與 0 3mLHBsAg 懸液混勻，置20 2 水浴條件下，作用10min ，測定該消毒劑 10min 抑制或破壞HBsAg 抗原性的最低有效濃度。E6 2 取消毒劑 10min 抑制或破壞HBsAg 抗原性的最低有效濃度與待選中和劑進(jìn)行試驗，試驗可按下列組另1J進(jìn)行：a.消毒液0. 9mL+HBsAg懸液0. 1mL; b.消毒液0. 4mL+HBsAg懸液0. 1mL作 用10min后

27、+含20%小牛血清的中和劑 0. 5mL; c.先取含20%小牛血清的中和劑 1mL與消毒液1mL, 混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液， 再行試驗。中和產(chǎn)物溶液0. 9mL+HBsAg懸液0. 1mL; d.含 10%小牛血清的 PBS0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；e.含10%小牛血清的中和劑 0.9mL+HBsAg懸液0.1mL; f.中和產(chǎn)物溶液 0. 9mL+PBs0. 1mL。經(jīng)檢測只有在 c、d、e組HBsAg活性的測定值相近（相差 10% 以下）并都明顯多于b 組， a 組 HBsAg 活性不能檢出或檢出活性明顯少于b 組， f 組陰性對照正常，方可證明所選中和劑

28、及其使用劑量是適宜的。E6 3 進(jìn)行消毒試驗時，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用量。再次按E6 2 步驟測定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗。E7 破壞試驗方法E7 1 懸液法懸液法指將HBsAg 在懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E7 1 1 HBsAg 懸液的濃度為檢測試劑靈敏度的 104 倍。如檢測試劑的靈敏度為 1ng/mL ， HBsAg 的濃度應(yīng)為10（ig/mL。E7. 1. 2 取含5%小牛血清的 PBS2. 7mL加到含0. 3mL濃度為100g/mL的HBsAg懸液中,混勻。E7 1 3 取小牛血清 20mL 加到含 80mL

29、 滅菌的中和劑溶液中，混勻。E7. 1. 4破壞試驗：將預(yù)定消毒液濃度 1. 25倍的消毒液與 HBsAg懸液按4 ： 1比例混合，混合液容量不少于1 5mL 。然后置 20 2水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時間，即刻取0 3mL 混合液與等體積含20%小牛血清的中和劑混勻， 作用1030min,取樣測定殘留HBsAg的活性，每一樣本平行測定 2份, 每份0. 1mL,取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀察3個濃度，每一濃度觀察 4個作用時間。試驗重復(fù) 5 次。E7 1 5 陽性對照：取含20小牛血清的中和劑1mL ，加到含 1mL 試驗用消毒液的試管中混勻，作用1030min,制成中和產(chǎn)物溶液。取

30、該中和產(chǎn)物溶液0. 9mL加入試驗濃度的 HBsAg懸液0. 1mL取樣檢測，每一樣本檢測 3 份，每份 0 1mL ，取其平均值為陽性對照值。E7 1 6 陰性對照：取含 20小牛血清的中和劑 1mL 加到含 1mL 試驗用消毒液的試管中，混勻，作用1030min,取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0. 1mL取其平均值為陰性對照值。應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。E7 2 載體法載體法指將在載體表面的 HBsAg 與消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E7 2 1 HBsAg 載體的制備E7 2 1 1 載體為直徑1 5cm 大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸汽滅菌備用。E7. 2. 1. 2 HBsAg懸液的濃度為檢測方法靈敏度的5X104倍。如靈敏度為 1ng/mL, HBsAg的濃度應(yīng)為50g/mL。E7 2 1 3 HBsAg 的污染方法為滴染法。滴染時，將滅菌載體平鋪于無菌平皿內(nèi)，用微量進(jìn)樣器吸取HBsAg懸液，滴注于載體中央，每個載體20 L。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放 37c培養(yǎng)有f 4060min,待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗。E7 2 2 抗原性破壞試驗取污染HBsAg的載體，平放于無菌平皿內(nèi)，用吸管吸取預(yù)定濃