16SrRNA在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用

1、題目名稱： 16S rRNA 在細(xì)菌鑒定和分類中的使用學(xué)生姓名：劉 *學(xué) 號(hào)：學(xué)16304110*專 業(yè)：生物化學(xué)及分子生物學(xué)結(jié)業(yè)課程：系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)2016年12月16S rRNA在細(xì)菌鑒定和分類中的使用文 U* 2016304110*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢摘要:由于細(xì)菌種屬間生理生化特征的相似，單憑傳統(tǒng)的表型和化學(xué)鑒 定方法已無(wú)法準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。隨著包括PCR技術(shù)、測(cè)序技術(shù)等分子技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)菌的分類鑒定也由在最初的表型和化學(xué)鑒定演變到分子水 平，使人們可以通過(guò)對(duì)細(xì)菌的 DNA鑒定來(lái)達(dá)到區(qū)分種屬的目的。細(xì)菌的 16S 核糖體RNA(rRNA)以其在進(jìn)化上的特征性序列，基因序列

2、的保守性和存在的 普遍性，使用16S rRNA作為分子指標(biāo)已逐漸成為微生物檢測(cè)和分類鑒定的一 種強(qiáng)有力工具。本文就16S rRNA在細(xì)菌鑒定和分類研究中的進(jìn)展做一綜述。關(guān)鍵詞：16S rRNA;細(xì)菌分類鑒定；DNA測(cè)序；高級(jí)結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)的細(xì)菌系統(tǒng)分類的主要依據(jù)是形態(tài)特征和生理生化性狀，采取的主要方法是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，然后從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征以及免疫學(xué)特性 等方面加以鑒定。大量菌種的分類鑒定是一項(xiàng)繁瑣、費(fèi)時(shí)的工作，因此迫切需 要建立一種簡(jiǎn)單、方便、易于操作的分類鑒定方法，使人們?cè)谝欢ǔ潭壬细?科學(xué)、精確、快速地找到微生物的分類地位，為微生物資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基 礎(chǔ)。20世紀(jì)60年代開(kāi)始，分

3、子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使細(xì)菌分 類學(xué)進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代，許多新技術(shù)和方法在細(xì)菌分類學(xué)中得到廣泛使用。 在PCR技術(shù)的產(chǎn)生發(fā)展基礎(chǔ)上，產(chǎn)生了許多新的分類方法，如質(zhì)粒圖譜、限 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、PCR指紋圖、rRNA基因(rDNA)指紋圖、16S核糖 體核糖核酸(rRNA)序列分析等。這些技術(shù)主要是對(duì)細(xì)菌染色體或染色體外的 DNA片段進(jìn)行分析，從遺傳進(jìn)化的角度和分子水平進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定，從而 使細(xì)菌分類更科學(xué)、更精確。特別是 16S rRNA基因序列分析技術(shù)的出現(xiàn)，使 細(xì)菌進(jìn)化和否可以通過(guò)試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。 目前，關(guān)于PCR擴(kuò)增16S rRNA基因 用于細(xì)菌分類和鑒定的研究越來(lái)越

4、多，大多數(shù)細(xì)菌的16S rRNA基因均已被測(cè)序。本文就16S rRNA在細(xì)菌鑒定和分類研究中的進(jìn)展做一綜述。1.16S rRNA 基因16S rRNA為原核生物的一種核糖體 RNA。目前，細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中 最有用和最常用的分子鐘是rRNA,其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA總量的 80%),分子大小適中，在漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化過(guò)程中，其基因序列的變化非常緩慢，可以用來(lái)標(biāo)記生物的進(jìn)化距離和親緣關(guān)系具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)；在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。細(xì)菌中編碼rRNA基因按5、.16S.23S.5S.3方式排列的，由2個(gè)非編碼的問(wèn) 隔區(qū)序列（InternalTranscribed

5、Spacers ITS）分開(kāi),5SrRNA、16S rRNA 和 23SrRNA3部分組成一個(gè)RNA操縱子，作為一個(gè)單位轉(zhuǎn)錄，再加工成為成熟 rRNAo 16S rRNA是所有原核生物蛋白質(zhì)合成必需的1種核糖體RNA ,其具 有以下特點(diǎn)：（1）多拷貝。每個(gè)細(xì)菌含510個(gè)16S rRNA拷貝，這使得檢測(cè)敏感 性較高。（2）多信息。16S rRNA基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū) 為所有細(xì)菌所共有，可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在不同程度的差異，具有屬或種的特異性，可變區(qū)和保守區(qū)交錯(cuò)排列。因此，可根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)各種細(xì)菌的通 用引物，也可根據(jù)可變區(qū)設(shè)計(jì)特定細(xì)菌的特異引物或探針。16S rRNA基因可

6、變區(qū)所含信息的種間差異，使檢測(cè)具有特異性。（3）長(zhǎng)度適中。16S rRNA編碼基因長(zhǎng)度約1500bp,包含大約50個(gè)功能域。2. 16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌的原理和方法通過(guò)比較各類生物16S rRNA的基因序列，從序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn) 化距離，可以繪出生物進(jìn)化樹(shù)。因此，16S rRNA序列分析技術(shù)的基本原理就 是從微生物樣本中16S rRNA的基因片段，通過(guò)克隆、測(cè)序或酶切、探針雜交 獲得16S rRNA序列信息，再和16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)或其他數(shù)據(jù)進(jìn) 行比較，確定其在進(jìn)化樹(shù)中位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。2.1 基因組DNA的獲得首先從微生物樣品中直接提取總

7、DNA,對(duì)易于培養(yǎng)的微生物可通過(guò)培養(yǎng)富集后再進(jìn)行提取。另一種選擇是提取微生物細(xì)胞中的核糖體RNA。一個(gè)典型的細(xì)菌含有10000個(gè)20000個(gè)核糖體，而基因組DNA中rrn操縱子（即rDNA 序列）的拷貝數(shù)相對(duì)較少（原核生物一般為1個(gè)10個(gè)左右），因此，rRNA在細(xì) 胞中的含量很高，易于獲得較多的模板，但是 RNA易于降解，RNA的提取技 術(shù)相對(duì)于DNA的提取較為復(fù)雜，一般研究多采用提取細(xì)胞總 DNA,但也可根 據(jù)情況選擇提取rRNAo由于rRNA在死亡的細(xì)胞中很快降解，提取 rRNA通 過(guò)反轉(zhuǎn)錄釣取16SrDNA序列的方法能夠區(qū)分被檢測(cè)的細(xì)胞是否為活體細(xì)胞。2.2 16S rRNA基因片段的獲

8、得過(guò)去常常將提取的總 DNA經(jīng)酶切后克隆到入噬菌體中建立 DNA庫(kù)，進(jìn)步通過(guò)16S rRNA通用探針進(jìn)行雜交，篩選含有16SrDNA序列的克?。B(niǎo)槍法)。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，現(xiàn)在一般采用 16S rRNA引物PCR擴(kuò)增總 DNA中的rRNA序列，或通過(guò)反轉(zhuǎn)錄 PCR獲得互補(bǔ)CrDNA序列后再進(jìn)行分 析。采用PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于不僅一次性從混合 DNA或RNA樣品中擴(kuò)增出 16S rRNA序列，而且方便了后面的克隆和測(cè)序。但也同樣會(huì)出現(xiàn)PCR所固有的缺點(diǎn)，尤其是采用16S rRNA保守序列的通用引物對(duì)多種微生物混合樣品進(jìn) 行擴(kuò)增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(Chimericproduct)和擴(kuò)增偏

9、嗜性現(xiàn)象，影響結(jié)果的 分析。2.3 通過(guò)16S rRNA基因片段分析對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下 3種:將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì) 粒載體上進(jìn)行測(cè)序，和16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，確定其在進(jìn)化樹(shù) 中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類，該方法獲得的信息最全面， 但在樣品成分復(fù)雜的情況下需要大量的測(cè)序工作。通過(guò)16S rRNA種屬特異性的探針和PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。止匕外，探針也可以直接和 樣品進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，通過(guò)原位雜交不僅可以測(cè)定微生物的形態(tài)特征和豐度， 而且能夠分析它們的空間分布。該方法簡(jiǎn)單快速，主要使用于快速檢測(cè)，但可 能

10、出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)分析，通過(guò)觀察酶切電泳圖譜、 數(shù)值分析，確定微生物基因的核糖體型，再同核糖體庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，分 析樣品中微生物組成或不同微生物的種屬關(guān)系。3. 16S rRNA可變區(qū)序列在細(xì)菌分類鑒定中的使用研究細(xì)菌16S rRNA中含有9個(gè)可變區(qū)，命名為 V1V9區(qū)。確定某個(gè)可變區(qū) 內(nèi)具有細(xì)菌種特異性的序列就可能獲得細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室診斷的有用靶點(diǎn)。除V2、V3、V4區(qū)稍長(zhǎng)外#其他各高變區(qū)序列都很短，沒(méi)有哪個(gè)高變區(qū)能區(qū)分所有細(xì)菌。 Chakravorty等

11、對(duì)110種細(xì)菌(分別來(lái)自于人體、環(huán)境及美國(guó)疾病預(yù)防控制中心 鑒定的致病菌)共113份完整的16S rRNA的V1V8區(qū)序列進(jìn)行詳細(xì)研究，分 別構(gòu)建了基于 V1V8區(qū)序列的特異性系統(tǒng)樹(shù)(dendrogram) 0結(jié)果顯示，V1 區(qū)能區(qū)分金黃色葡萄球菌和血漿凝固酶陰性葡萄球菌；V2和V3區(qū)能將除腸桿菌科以外的細(xì)菌鑒別至屬的水平，V2區(qū)尤其適合于鑒別分枝桿菌屬內(nèi)的菌種； V3區(qū)能很好區(qū)別嗜血桿菌屬內(nèi)各種細(xì)菌；V6區(qū)也能區(qū)分除腸桿菌科以外的大 多數(shù)菌種，特別是通過(guò)單核甘酸多態(tài)性(SNP)分析可將炭疽芽胞桿菌從和其 生物學(xué)性狀非常相似的蠟樣芽胞桿菌群細(xì)菌中區(qū)分開(kāi)來(lái)；而通過(guò)V4、V5、V7和V8區(qū)序列來(lái)鑒

12、別細(xì)菌至屬或菌種的可能性不大。Jacob等收集了 31株弗朗西斯菌屬的細(xì)菌及96份臨床分離株，通過(guò)對(duì)16S rRNAVI區(qū)37個(gè)核甘酸片段 的PCR擴(kuò)增和測(cè)序#不僅能將臨床或環(huán)境標(biāo)本中的弗朗西斯菌屬成功鑒定出來(lái)， 結(jié)合SNP分析（根據(jù)第12位核甘酸T/G不同）還可將弗朗西斯菌屬的細(xì)菌分 成2個(gè)組，引起人類和動(dòng)物土拉熱病的土拉熱弗朗西斯菌 （Francisella tularensi§ 的3個(gè)亞種均在第1組，其他幾個(gè)菌種則全在第2組。因此，該方法可快速甄 別具有強(qiáng)傳染性的士拉熱弗朗西斯菌。4.16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析在細(xì)菌分類鑒定中的使用1981年Noller等以E.coli的16

13、S rRNA為研究對(duì)象，綜合化學(xué)修飾、蛋白 結(jié)合、酶切片段等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，初步推斷除了16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，首次并對(duì)該模型的特征進(jìn)行了簡(jiǎn)要描述。Woese認(rèn)為，早期對(duì)于rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研 究都只限于部分序列，結(jié)果并不可靠。1983年，Woese等在原有的基礎(chǔ)上，比 較分析了真細(xì)菌域、古細(xì)菌域和真核生物域 150多個(gè)物種16S rRNA全系列， 詳細(xì)論述了三域生物16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)序列比較方法不但是預(yù) 測(cè)假設(shè)結(jié)構(gòu)的一個(gè)有力工具，而且有利于發(fā)現(xiàn)該分析的重要功能區(qū)段，同時(shí)指 出二級(jí)結(jié)構(gòu)上的改變可能導(dǎo)致能量變化并影響到功能。隨后，很多研究者也加入到16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究

14、中來(lái)，對(duì)其模型不斷改進(jìn)和完善。Neefs在1993 年簡(jiǎn)述了真細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物的核糖體小亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖以及相 互之間的主要區(qū)別，這對(duì)于以后的理論研究具有重要的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。Wisotzkey對(duì)芽抱桿菌屬（Bacillus）的16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，比 較了 16S rRNA部分同源區(qū)段的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合脂肪酸類型，從中劃分出 一個(gè)新屬：脂環(huán)酸芽抱桿菌屬（Alicyclobacillus ）。國(guó)內(nèi)在16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu) 領(lǐng)域的研究工作起步較晚。2003年，陳朝銀等對(duì)Thermaceae# 38株菌的16S rRNA序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析，重點(diǎn)研究了 16S rR

15、NA的特征性核甘酸和二級(jí)結(jié) 構(gòu)特征，將38株菌劃分為18個(gè)種，此結(jié)果和NCBI中的分類基本一致。郭春 雷等對(duì)所分離得到的幾株棲熱菌屬（Thermus）的菌株和該屬一些有效發(fā)表進(jìn) 行了基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析，預(yù)測(cè)并比較了 16S rRNA部分區(qū)段的二 級(jí)結(jié)構(gòu)，利用內(nèi)環(huán)、內(nèi)環(huán)和發(fā)卡環(huán)之間堿基對(duì)數(shù)目以及發(fā)卡環(huán)的堿基數(shù)目區(qū)分 種間差異，證明16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以用來(lái)區(qū)分種一級(jí)的分類單位。陳國(guó)忠 采用16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形分析，比較了姜氏菌屬及幾個(gè)相關(guān)屬種可 變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化?？梢詫iangelle和其他種屬彼此區(qū)分開(kāi)，為姜氏菌屬的建立提供了又一個(gè)有意義的分子指證。姜怡

16、采用16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形分析，比較了閻氏菌科閻氏菌屬典型種和微球菌屬亞目中幾個(gè)相關(guān)科屬典型 種可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。5 .細(xì)菌鑒定中存在的挑戰(zhàn)和困難5.1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增假陽(yáng)性問(wèn)題盡管細(xì)菌16S rRNA存在多個(gè)保守區(qū)，但沒(méi)有針對(duì)哪個(gè)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的 PCR引物適合于擴(kuò)增所有細(xì)菌。細(xì)菌、衣原體、螺旋體、立克次體等不同種類 微生物之間16S rRNA保守區(qū)雖然存在共有序列 （consensussequence但各種 類間仍存在若干堿基不同即增細(xì)菌的“通用引物”也是相對(duì)的，通常是在共 有序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一套引物。因此，針對(duì)被檢微生物的種類不同或臨床標(biāo)本 不同，應(yīng)選擇相對(duì)應(yīng)的通用引物，

17、才能達(dá)到特異擴(kuò)增效果。如果引物設(shè)計(jì)不當(dāng)， 還可出現(xiàn)和人基因組的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致 PCR結(jié)果錯(cuò)誤判讀。由于PCR本身的 高敏感度，極微量污染也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。污染可發(fā)生在標(biāo)本采集、核酸提取 乃至PCR操作各環(huán)節(jié)，尤其是在標(biāo)本（腦脊液，胸，腹腔積液，心瓣膜或活 檢標(biāo)本等）采集環(huán)節(jié)中最易發(fā)生。因此，在 PCR擴(kuò)增及其測(cè)序的各環(huán)節(jié)都必 須建立并遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）。5.2 分離株測(cè)序鑒定的篩選問(wèn)題細(xì)菌16S rRNA測(cè)序鑒定需進(jìn)行DNA擴(kuò)增、測(cè)序和分析，其設(shè)備條件和 實(shí)驗(yàn)成本比傳統(tǒng)的表型鑒定更高， 且不能對(duì)所有細(xì)菌都鑒定至種的水平， 這是 目前一般臨床實(shí)驗(yàn)室尚未普及該項(xiàng)目的原因之一。Mahlen

18、等設(shè)計(jì)了一套嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選策略，如形態(tài)學(xué)和生化檢測(cè)結(jié)果不一致或十分奇怪的分離株、和疾病的相關(guān)性或解剖位置不相符的分離株、 在淺層傷口或呼吸道標(biāo)本存在炎性細(xì)胞時(shí) 分離出的優(yōu)勢(shì)菌株、尿道標(biāo)本中分離出的菌量達(dá)10A410A5CFU/ml的菌株正 常時(shí)無(wú)菌體液中分離出的量很多的菌株等 $只對(duì)這些分離株進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定。 就革蘭陰性桿菌和球菌而言，實(shí)際需進(jìn)行 16S rRNA測(cè)序鑒定的只占其總種類 的1.6%。采用一般表型鑒定方法能正確鑒定的絕大多數(shù)分離株不需DNA測(cè)序，以符合臨床細(xì)菌鑒定的低成本、省時(shí)、高效的要求。6 .總結(jié)和展望由于16S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定 性

19、，序列分析的重現(xiàn)性極高，基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn)，使用 16S rRNA作為 分子指標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。分子分類正是在從研究的目的過(guò)渡到研究的手段。隨著分子分類的理論和方法的日趨成熟，其已逐步成為微生物資源調(diào)查和環(huán)境生態(tài)研究的一種強(qiáng)有力的工具。16SrRNA基因PCR擴(kuò)增和計(jì)算機(jī)分析相結(jié)合已被證明是鑒定病原菌快速、有效、 準(zhǔn)確的方法，再加上生物芯片的不斷開(kāi)發(fā)，相信感染性疾病病原菌的檢測(cè)將邁 上更高的臺(tái)階。參考文獻(xiàn)1 Shang S, Chen Z , Yu X .Detection of bacterial DNA by PCR and reverse hybridizat ion in the 16S rRN A gene w i th particular