大腸桿菌試驗(yàn)報(bào)告

1、大腸桿菌紫外線誘變及抗藥性菌株篩選0740063阿磨蘭 1.前言抗生素能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌的繁殖和生長(zhǎng)受到抑制。但某些細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出抗性，原因是其基因發(fā)生了改變，產(chǎn)生能抵抗抗生素的性狀。在自然情況下，細(xì)菌的基因突變率很低，而且突變是不定向的，因此在自然條件下， 想要獲得有抗性的細(xì)菌是很困難的。當(dāng)給與適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件時(shí)，其突變率會(huì)大大增加。如當(dāng)用a射線、3射線、丫射線、 X射線、中子和其他粒子、紫外線、微波等物理因素輻射時(shí)，能夠促進(jìn)遺傳物質(zhì)突變。DNA對(duì)紫外線（UV）有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的喀咤，它比喋吟更為敏感。紫外線引 起DNA結(jié)構(gòu)變化的形式有 DNA鏈斷裂、堿基破壞、胸

2、腺喀咤二聚體等。因此，紫外線通常作為誘變劑，用于微生物菌種選育。一般細(xì)胞分裂越旺盛，誘變劑量越大，突變率高，誘變最有效的波長(zhǎng) 253265 nm。選擇合適的誘變劑量對(duì)于獲得較高突變率十分關(guān)鍵，過(guò)高 或過(guò)低的輻射劑量會(huì)導(dǎo)致菌株死亡或誘變不充分而降低誘變效果。在紫外線誘變下，菌株發(fā)生不定向的突變，想要得到需要的特向變異必須對(duì)誘變后的菌 株做篩選。本實(shí)驗(yàn)想要得到的是能夠抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行篩選。若菌株沒(méi)有發(fā)生定向突變，則該菌株不能在抗性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)， 只有發(fā)生了定向突變才可能在篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。紫外線對(duì)于菌株有誘變作用外，對(duì)菌株還有較強(qiáng)的致死作用，

3、因?yàn)樽贤饩€改變了菌株的 基因結(jié)構(gòu)導(dǎo)致菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)繁殖。因此，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的操作，在合適的照射劑量的設(shè)置下，比較不同不同照射劑量下的致死效果和突變率，并初步分析兩者的相關(guān)性。在分析死亡曲線和誘變率曲線的基礎(chǔ)上，能了解誘變育種的機(jī)理和方法，為做進(jìn)一步的誘變實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。2.材料和方法實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑 菌種：大腸桿菌 儀器：超凈臺(tái)、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、培養(yǎng)皿、涂布器、移液管、移 液器試劑：牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基相關(guān)試劑、硫酸卡那霉素水溶液（ 50mg/ml ）、生理鹽水 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1制備培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基（400ml）：牛肉膏5g 蛋白月東10g Nacl

4、 5g 瓊脂20g 蒸儲(chǔ)水1000ml按配方配制好培養(yǎng)基后置于滅菌鍋中115c 15min,倒平板，4皿*15ml*5組+2皿*15ml=22皿 *15ml=330ml 篩選培養(yǎng)基（200ml）：含抗生素50mg/L。（卡那霉素屬于氨基糖昔類抗生素，能結(jié)合細(xì)菌核糖體白30S亞基上的16SrRNA,阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。）牛肉膏5g 蛋白月東10g Nacl 5g 瓊脂20g蒸儲(chǔ)水1000ml硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml ）,按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115 C 15min滅菌，取出培養(yǎng)基后冷卻至60 c時(shí)將硫酸卡那霉素加入培養(yǎng)基中，充分震蕩混勻，倒平板，2皿*15ml*5組+2皿

5、*15ml=12 皿 *15ml=180ml 2.2.2制備菌懸液（106 108個(gè)/mL） 固體培養(yǎng)：大腸桿菌劃線或涂布接種于固體培養(yǎng)基，37c培養(yǎng)24-48h。菌懸液：用適量生理鹽水刮洗菌落，倒入一個(gè)無(wú)菌小三角瓶（或試管）中，充分振蕩使菌體散開，得到菌懸液。菌懸液濃度用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。將菌液滴在血球計(jì)數(shù)板 0. 1ml的計(jì)數(shù)格中，細(xì)菌被固定染色后，在顯微鏡下選擇數(shù)出若干個(gè)小格中的細(xì)菌數(shù)目，（一般數(shù)125個(gè)小格），根據(jù)比例關(guān)系折算出單位體積菌液中細(xì)菌的數(shù)量。血球計(jì)數(shù)板規(guī)格：計(jì)數(shù)格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格小格體積=*=*10 -7m

6、l（長(zhǎng)*寬*高）計(jì)算方法例如：125格中90個(gè)細(xì)菌，則（90+ 125） + （ *10-7）個(gè)/ml=*10 6所以，125格中的細(xì)菌大約在 31（4格1個(gè)菌）一3125 （每個(gè)小格25個(gè)菌）個(gè)。2.2.3 誘變處理及接種 將紫外燈打開，預(yù)熱 30min ; 取無(wú)菌培養(yǎng)皿（90mm,含無(wú)菌大針），加入稀釋好的菌懸液 8ml以覆蓋培養(yǎng) 皿底面為宜。 將待處理的培養(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，開啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌1分鐘，然后打開皿蓋，分別處理10s、20s、40s、80s、160s （可以累積照射），照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉攪拌和紫外燈； 每個(gè)照射劑量分別取分別稀釋1000倍和100

7、倍，然后取稀釋液做普通培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)，每個(gè)處理兩個(gè)重復(fù)；同時(shí)每個(gè)照射劑量取照射液直接做兩個(gè)篩選 培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)。 對(duì)照涂布培養(yǎng)：將照射的菌液稀釋1000倍，在稀釋液中取做 2個(gè)普通培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，2個(gè)篩選培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)。涂布要均勻，培養(yǎng)基表面無(wú)液流。37c培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于篩選的抗性菌種進(jìn)行驗(yàn)證、純化。2.2.4 .結(jié)果計(jì)數(shù)、分析、統(tǒng)計(jì)及討論以輻射時(shí)間為橫坐標(biāo)，以存活菌落數(shù)的lg值為縱坐標(biāo)，作紫外線對(duì)大腸桿菌致死效應(yīng)曲線。列公式計(jì)算不同輻射劑量下的致死率。死亡率100%照射前活菌數(shù)/ml照射后活菌數(shù)/ml照射前活菌數(shù)/ml計(jì)算并比較不同輻射劑量下大腸管桿菌的抗藥突變率，并

8、分析不同輻射劑量的誘變效果差異原因突變率=篩選平板菌數(shù)/普通平板菌數(shù)*100%抗藥性菌株的篩選與純化將一抗性克隆劃線到一新的抗性平板上，與對(duì)照菌相比較，觀察生長(zhǎng)狀況3.結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄及初步整理表1.大腸桿菌誘變初始數(shù)據(jù)照射時(shí)間篩選培養(yǎng)基活菌數(shù)普通培亦卜 稀釋度普通培養(yǎng)基中菌數(shù)溶液濃度個(gè)/ml1號(hào)個(gè)/皿2號(hào) 平均1號(hào)個(gè)/皿2號(hào)平均0000100500056005300*10700010-2200018201820*1061000010-3366251251*10600010-22564*1042000010-32011*10400010-2253*1034000010-300000001

9、0-250*1038000010-3400202*10 500010-2000016000010-30000最佳照射時(shí)間的設(shè)置結(jié)合數(shù)據(jù)處理結(jié)果的圖和表分析，在10s的照射下，細(xì)菌死亡率達(dá)到了 95%, 20s時(shí)達(dá)到了 %,說(shuō)明在20s內(nèi)大部分菌株已經(jīng)死亡，而整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生任何正突變，可能與此有較大關(guān)系。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)菌種死亡率達(dá)到70%80%寸，突變率最大。所以在做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該減少照射劑量，或通過(guò)增多10s內(nèi)的照射設(shè)置，或增大照射距離，因?yàn)闀r(shí)間太短可能導(dǎo)致控制實(shí)驗(yàn)的難度加大。使死亡率變化曲線能突顯出變化趨勢(shì)。篩選培養(yǎng)基選擇該實(shí)驗(yàn)中的篩選培養(yǎng)基但這抗性也是有一定范50mg/L,實(shí)

10、驗(yàn)證明該篩選培養(yǎng)基是將發(fā)生突變的菌株從普通菌株中顯現(xiàn)出來(lái)并對(duì)其濃縮。中的添加劑是硫酸卡那霉素， 若發(fā)生突變的菌株能對(duì)其顯現(xiàn)出抗性, 圍的，若超過(guò)其抗性范圍即使發(fā)生突變也不能正常生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用的濃度對(duì)于該菌種抗性選育來(lái)說(shuō)已經(jīng)過(guò)高，應(yīng)該選擇較低的濃度?？梢栽谠囼?yàn)前對(duì)該菌種的最低致死濃度做檢測(cè)。將制備好的出發(fā)菌株溶液涂布在含不同濃度硫酸卡那霉素的平板上37 c培養(yǎng)24h,觀察不同平板上的菌落數(shù)，并記錄不同抗生素作用濃度。凡是在前一個(gè)低濃度，后一濃度即為某種抗生素對(duì)出平板上已長(zhǎng)出菌落而在后一個(gè)較高濃度平板上未長(zhǎng)出菌落的 發(fā)菌株的最低致死濃度【1】。表2.不同照射劑量下的存活率lg值和死亡率照射時(shí)間/

11、s存活菌濃度存活菌的lg值死亡菌濃度致死率 0*1070010*106*10720*104*10740*103*10780*103*1071600*1071存活曲線801 -0 111'050100150200照射時(shí)間照射時(shí)間4.小結(jié)與討論(1)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行紫外線照射，欲得到抗性菌株，但由于照射劑量過(guò)大 和抗生素濃度過(guò)高等原因未得到任何一株抗性菌株。(2)通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，得到了在28cm,下大腸桿菌的照射致死致死曲線，可以依此曲線反回歸在該照射條件下選擇合適的照射時(shí)間得到較高的突變率。(3)欲得到較高的抗性突變率，還可嘗試改變培養(yǎng)溫度，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同的溫度培養(yǎng)會(huì)對(duì)細(xì)菌的突變率造成影響【2】。(4)欲得到較好的突變率還需要較優(yōu)質(zhì)的菌株。因?yàn)榫甑耐蛔冎饕前l(fā)生在遺傳物質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，所以菌株的生理活性對(duì)突變效率會(huì)有很大影響，最好選擇在對(duì)數(shù)期的菌株。狀況比較同步、易變