獸醫(yī)生物制品學.doc

1、獸醫(yī)生物制品學：是以預防獸醫(yī)學和生物工程學理論為基礎(chǔ)，研究動物傳染病和寄生蟲病的免疫預防、診斷和治療用生物行制品的制造理論和技術(shù)、生產(chǎn)工藝、制品質(zhì)量檢驗與控制及保藏和使用方法，以增強動物機體特異性和非特異性免疫力，及時準確診斷動物疫病，并給予特異性治療，防止疫病傳播的綜合性應用學 科。獸醫(yī)生物制品：是根據(jù)免疫學原理，利用微生物、寄生蟲及其代謝產(chǎn)物或免疫應 答產(chǎn)物制備的一類物質(zhì)，專供相應的疫病診斷、治療或預防之用。疫苗：凡接種動物后能產(chǎn)生自動免疫和預防疾病的一類生物制劑均稱為疫苗，包含細菌性疫苗、病毒性疫苗和寄生蟲行疫苗。獸醫(yī)生物制品學的應用： 免疫預防；診斷；治療生物制品安性質(zhì)分類：疫苗、類毒

2、素、診斷制品、抗病血清、微生物制劑、副免 疫制品。疫苗安抗原的性質(zhì)和制畬工藝分為:活疫苗、死疫苗、基因疫苗活疫苗與死疫苗的優(yōu)缺點比較：活疫苗可以在免疫動物體內(nèi)繁殖，能刺激機體產(chǎn)生全面的系統(tǒng)免疫反應和局部免疫反應；免疫力持久，有利于清除局部野毒；產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低。但是該類疫苗殘毒在自然界動物群體內(nèi)持續(xù)傳遞后有毒力增強和返祖危險；有不同抗原的干擾現(xiàn)象；要求在低溫, 冷暗的條件下運輸和儲存。死疫苗不能在免疫動物體內(nèi)繁殖，比較安全，不發(fā)生全身性副作用，無毒力返祖現(xiàn)象；有利于多價或多聯(lián)等混合疫苗；制備穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響 小，有利于保存和運輸。但該類疫苗生產(chǎn)成本高，需多次免疫。而且一般只能 誘導機體產(chǎn)

3、生體液免疫和免疫記憶，故常需用佐劑或攜帶系統(tǒng)來增強其免疫效 果。滅活：指破壞微生物的生物學活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性?；蛑钙茐脑\斷血清或待檢血清中的補體活性，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。用于滅活微生物的化學試劑或藥物 。微生物致弱：是指通過各種方法使病原微生物的致病性降低或喪失，但其它生物學活性以及免疫原性并未發(fā)生本質(zhì)性改變。滅活劑：用于滅活微生物的化學試劑或藥物滅活劑的種類：1 .甲醛溶液2.常用烷化劑：3.苯酚：4.結(jié)晶紫 甲基青蓮 甲紫5. B-丙酰內(nèi)酯 影響滅活作用的因素（1）滅活劑特異性 （2）微生物種類與特性 （3）滅活劑濃度 （4）滅活劑溫度 （5）滅活

4、時間（滅活時間與滅活劑濃度和作用溫度密切相關(guān)）（6）酸堿度（在微酸性時滅活速度慢，抗原性保持較好；堿性時滅活速度快，擔抗原性易受破壞（7）有機物存在。保護劑：又稱穩(wěn)定劑，指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞的 物質(zhì)。保護劑是保護微生物和寄生蟲等活力和免疫力及酶和激素等生物活性的一 類物質(zhì)，還包括細菌或病毒的營養(yǎng)液、賦形劑和抗氧化劑。疫苗凍干保護劑組成2 .營養(yǎng)液：可修復因凍干而受損的細胞，使凍干制品含有一定量水分；可促進高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀，增加溶解度3 . 賦形劑：防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，保護活性物質(zhì)不受加熱影響使凍干 制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，

5、增加溶解度。4 .抗氧化劑：抑制凍干制品中的酶作用，增加生物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間 的穩(wěn)定性，如維生素 C、維生素E和硫代硫酸鈉等。防止活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而導致生物活性物質(zhì)的損傷； 降低細胞內(nèi)外的滲透壓差、防止細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保持細胞的活力； 保護或提供細胞復蘇所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力的復蘇和迅速修復自身。佐劑：傳統(tǒng)講：當一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發(fā)揮其輔佐作用者，都稱之為佐劑新概念：凡是可增強抗原特異性免疫應答的物質(zhì)均稱為佐劑。佐劑種類：1 .按佐劑物理性質(zhì)：顆粒型佐劑、非顆粒型佐劑2

6、.按佐劑的生物學性質(zhì)（即 Ballanti分類法）：微生物及其組分、非微生物物質(zhì)3 .按佐劑在體內(nèi)存留的時間：貯存型佐劑、非貯存型油乳佐劑：屬于一種儲存型佐劑，是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合 形成的佐劑。乳劑：是將一種溶液或干粉分散成細小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。 被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。乳化劑的種類：1.天然乳化劑:一來自植物、動物2.人工合成乳化劑： 分離子型（陰離子型、陽離子型）和非離子型：多元醇或聚合多。油乳佐劑的制備（以制備白油佐劑為例）:1、白油佐劑制備；取_7號白油470mL

7、 司本-80 30mL 解脂酸鋁10g,混合后用力振搖,116度高溫滅菌,取 30-40ml ,冷卻至50度左右,再用力振搖至透明均質(zhì)狀，即為白油體齊上2、乳化：（1）、取自制的組織滅活液 5ml,加入24%的吐溫-80混勻。（2）、將白油佐劑與水按3:12:1混勻。（3）、用勻漿機或者注射器乳化（4）、取乳化后 的乳劑滴入水中，檢測乳化效果。生物制品菌（毒）種標準：生物學特性明顯、歷史清楚；遺傳學上相對純一與穩(wěn)定；反應原性與免疫原性優(yōu)良；毒力應在規(guī)定范圍以內(nèi)弱菌（毒）種選育自然弱毒株的選育：1.同源動物（如ND LaSota株）、2.異源動物（如 MD FC126株）人工誘變致弱：1.化學途

8、徑：亞硝基服、醋酸鴕、洗衣粉 2.物理途徑：高溫、紫外線3.生物途徑：適應非易感動物或細胞；雜交減毒細菌培養(yǎng)技術(shù)（一）細菌分離與培養(yǎng)1 .需氧菌的分離培養(yǎng)：常用營養(yǎng)瓊脂平板分離方法：劃線接種法；傾注培養(yǎng)法2 .厭氧菌的分離培養(yǎng)：多數(shù)在二氧化碳條件下進行。最簡便的培養(yǎng)方法使用有蓋 玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒產(chǎn)生二氧 化碳，燃燭即刻熄滅。此時容器內(nèi)含有較高的二氧化碳濃度，再將容器放入適宜溫度培養(yǎng)即可。（二）細菌的規(guī)模化培養(yǎng)1.種子接種量： 通常為1%2%2.培養(yǎng)時間： 多數(shù)在對數(shù)繁殖后期至穩(wěn)定前期活菌數(shù)量高，生命力最強，宜于收獲。 3.培養(yǎng)方法： 固體表面培養(yǎng)法

9、 液體靜置 培養(yǎng)法 適于一般性細菌疫苗生產(chǎn) 液體深層通氣培養(yǎng)發(fā)法 透析培養(yǎng)法培養(yǎng)基的原料標準 ： 1.水（生活用水標準） 2. 肉肝胃消化肉湯 3.蛋白胨 4.瓊脂 5.明膠（化學純CP）級以上即可6.酵母7.抑菌劑8.指示劑培養(yǎng)基分類:1 按原料來源分：天然培養(yǎng)基；人工合成培養(yǎng)基2 按理化性狀分：液體半固體 固體 生化培養(yǎng)基3 按用途分：基礎(chǔ) 營養(yǎng) 選擇 鑒別 增菌 厭氣 生化病毒培養(yǎng)方法：一、動物增殖病毒技術(shù)動物選擇標準：（ 1）大動物應來源于非疫區(qū) , 最好是未接種過相應病毒疫苗、 青壯年和健康（經(jīng)臨床檢查、檢疫）（ 2）對相應病毒易感，并十分敏感（ 3）經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康（

10、4）家兔、小鼠、大鼠應符合普通級或清潔級實驗動物標準；雞應屬非免疫雞或 SPF 級標準；犬貓應品種明確，且符合實驗動物標準。（ 5）體重、年齡要基本一致，個體差別不宜過大二、接種方法 :根據(jù)病毒及研究目的的不同，可采用不同途徑進行接種：皮下接種、皮內(nèi)接種、肌肉接種、靜脈接種、腹腔接種和腦內(nèi)接種疫苗制造流程： 1. 活疫苗制備：種毒鑒定、種毒批制備，細菌、病毒或寄生蟲培養(yǎng)、鑒定，抗原純化或提取、配苗凍干及成品檢驗2.滅活疫苗制備：種毒鑒定、種毒純制備，細菌、病毒或寄生蟲培養(yǎng)、鑒定、抗原提取、滅活、配苗及成品檢驗細胞培養(yǎng)的方法 ：1 . 靜置培養(yǎng)：將細胞懸液接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，置恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)

11、，細胞長成致密的單層將細胞懸液接入轉(zhuǎn)瓶（塑料或玻璃瓶） ，放于恒溫箱的轉(zhuǎn)鼓上，進行培養(yǎng)2 .轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)通過振蕩或轉(zhuǎn)動的裝置，使細胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法3 .懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：能連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)收獲，不需胰酶消化，采用吹打即可分散，傳代細胞不受任何處理的損失， 從而可大量提高細胞數(shù)量， 提高生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量4 .微載體培養(yǎng)微載體 （microcarrier） ：直徑為 60105nm 的細小顆粒、無毒性、透明、顆粒密度與培養(yǎng)液近似、 略重于培養(yǎng)液、 低速攪拌即可懸浮、 表面光滑、硬度小、有彈性、不吸收培養(yǎng)液、易于吸附細胞5 . 中空纖維細胞培養(yǎng)中空纖維：由乙酸纖維、聚氯乙烯

12、-丙烯復合物、或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50-100um ，壁厚 2575um ，壁呈海綿狀，上有許多微孔，內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對細胞和大分子物質(zhì) （如單抗 ） 有滯留作用6 .微囊化細胞培養(yǎng)：適用于單克隆抗體的生產(chǎn)。先將雜交瘤細胞微囊化，置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開微囊，離心后可獲得高濃度的單抗弱毒疫苗 ：充分致弱，不含本病原或其它病原的強毒滅活疫苗 ：徹底滅活；選用優(yōu)質(zhì)佐劑，減少應激反應保障疫苗效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)1 .選擇（育）優(yōu)良的菌種和毒種，并保持其穩(wěn)定性2 .選用合適的繁殖細菌和病毒的方法，以獲得高滴度的

13、抗原量，并保持其良好的抗原性3 .使用合適的生產(chǎn)工藝4 .嚴格按標準進行質(zhì)量檢定菌種：免疫原性優(yōu)良的強毒菌株，老制品的菌種可向有關(guān)單位索取， 新制品的菌種需作全面鑒定種子液：將菌種接種于規(guī)定的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢驗合格即為種子液菌液培養(yǎng) ：將種子液接種于固體或液體培養(yǎng)基， 用固體表面培養(yǎng)法、 液體靜置培養(yǎng)法、液體搖振培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法等方法進行培養(yǎng)純檢 ：菌液培養(yǎng)完成后，取少量作純粹檢查，同時計算菌數(shù)滅活 ：用適當?shù)臏缁顒?（如 0.1% 甲醛）、在一定條件下（如 37過夜）滅活，同時或隨后加入防腐劑濃縮 ：為提高抗原量以獲得更好的免疫效果， 或在培養(yǎng)過程中未能達到所需

14、菌數(shù)，需用離心沉淀、氫氧化鋁吸附沉淀、羧甲基纖維沉淀法濃縮菌液配苗與分裝 ：滅活后的細菌可作為菌素苗適用；加入氫氧化鋁膠、蜂膠、油乳佐劑，制成鋁膠苗、蜂膠苗、油苗；制成油乳劑滅活苗時，需加入適量油乳佐劑，以保證抗原量，并充分乳化貼標簽 ：制品名稱、 用法用量、 保存方法、 有效期、 制造日期、 批準文號、 批號、檢驗號碼、制備細菌性活疫苗的程序與滅活菌苗基本一致， 不同之處在于： 其種毒為弱毒菌種、無滅活過程、菌苗需加保護劑凍動物組織苗制作一.動物的選擇1 . 應符合相應的等級要求，如清潔級以上2 .動物的品種、年齡和體重也需符合要求3 .制備組織滅活苗時，所選動物應是對所接種的病毒易感性高的

15、4 .制備組織弱毒苗時，所選動物則是培育該弱毒株時所用動物，如制備豬瘟兔化弱毒疫苗，選用兔子二、種毒與接種三、觀察與收獲1 . 組織滅活苗：按一定比例加入稀釋液 （滅菌生理鹽水 ）制成勻漿，加滅活劑滅活2 .弱毒組織苗：無菌操作剔除臟器上的脂肪與結(jié)蹄組織，稱重后，加入適量保護劑，制成勻漿，過濾，加入足量保護劑，及一定量的青、鏈霉素，充分混勻，于0-4 冰箱處理一定時間，無菌檢驗，分裝，凍干四、疫苗的配制許多病毒疫苗合適于用禽胚特別是雞胚制備， 如雞痘疫苗、 禽流感疫苗、 雞新城疫疫苗、鴨瘟疫苗、鴨肝炎弱毒疫苗等雞胚選擇： SPF 雞胚高免血清的制備：一、動物選擇與管理抗病毒血清的制備多用同種動

16、物品種：制備抗菌和抗毒素的血清多用異種動物,動物動物年齡和健康狀況： 體型較大、性情溫馴I、體質(zhì)強健的青壯年動物，自繁自養(yǎng)、專門動物場飼養(yǎng)、從非疫區(qū)購買動物的管理：精心管理、隔離飼養(yǎng)、建立動物檔案二、免疫原的制備免疫原：異物性、結(jié)構(gòu)的復雜性和一定的物理性狀1 .細菌抗原的制備與免疫2 .病毒抗原的制備與免疫3 .抗毒素血清制備三、免疫程序：第一階段為基礎(chǔ)免疫、第二階段為高度免疫接種途徑：皮下注射、肌肉注射 、皮內(nèi)注射、腹腔注射，抗原量大時，多部位 注射四、采血與分離血清試血：免疫過程中，經(jīng)試血決定是采血或繼續(xù)免疫采血：一般在最后一次免疫后的 710天，血清抗體效價可達到高峰，便可采血；分一次采

17、血和多次采血分離血清：自然凝固析出、自然凝固加壓法五、免疫血清的使用原則：正確診斷、盡早使用用法：皮下或肌肉注射，嚴重者靜脈注射用量：依動物體重不同而異;大動物為 1020 ml;豬羊等中等動物為-510ml,禽類為0.51ml抗病毒免疫血清的制備：以病毒為免疫原，須通過反復凍融或超聲裂解法，將病毒從細胞中釋放出來， 并盡可能地提高病毒滴度或和疫原性。如抗豬瘟血清，基礎(chǔ)免疫的抗原，可用豬瘟兔化弱毒疫苗；高度免疫抗原，則用豬瘟血毒或臟淋毒乳劑等強毒。豬接種豬瘟強毒發(fā)病后 5-7d,當出現(xiàn)體溫升高及典型豬瘟癥 狀時，由動脈放血，收集全部血液，經(jīng)無菌檢驗合格后即可作為抗原使用。GMP :是獸藥企業(yè)管

18、理生產(chǎn)和質(zhì)量的基本準則，適用于獸藥生產(chǎn)的全過程；或 者說是對獸藥企業(yè)（包括獸醫(yī)生物制品企業(yè)）生產(chǎn)全過程的質(zhì)量管理GMP內(nèi)容：涉及人員、廠房和設(shè)備、原料采購入庫、檢驗、發(fā)料、加工、半成 品檢驗、分包裝、成品檢定、產(chǎn)品運輸、銷售、用戶意見及處理等在內(nèi)的全過程 的質(zhì)量管理概括起來分為：1.人員：管理人員、專業(yè)技術(shù)人員和生產(chǎn)人員2.硬件：廠房和設(shè)施、設(shè)備、原材料3.軟件：管理制度和要求GMP的作用和特點一、GMP的實施涉及兩個方面：1 .政府獸醫(yī)藥政管理部門：從管理角度出發(fā)，把 GMP看成政府對獸藥企業(yè)（包括 獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)企業(yè)）提出的最低要求，并作為獸藥藥政部門檢查獸藥企業(yè)和獸藥質(zhì)量的依據(jù)2 .獸

19、藥企業(yè)：應把 GMP視為本企業(yè)所必須具備的技術(shù)水平，包括生產(chǎn)管理、質(zhì) 量管理和質(zhì)量監(jiān)測二、GMP是根據(jù)通用的原則性規(guī)定，針對我國所有獸藥企業(yè)而制定的。各獸藥 企業(yè)應按照GMP要求，制定更具體的實施細則和條例GMP 的主要目的是防止獸藥生產(chǎn)過程中的污染、混淆或其他事故，根除生產(chǎn)中的不良習慣，防患于未然，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全有效四、GMP雖調(diào)有效性的證實：對一個工序或一件用具或設(shè)備在用于生產(chǎn)之前，要經(jīng)過驗證，證明是符合要求和有效的，以保證產(chǎn)品質(zhì)量五、GMpg求生產(chǎn)管理部門和質(zhì)量控制部門的權(quán)力分立：生產(chǎn)部門和質(zhì)控部門是構(gòu)成GMP勺兩大要素，但在組織上其地位平行，其領(lǐng)導應由兩人分別承擔六、GMP雖調(diào)人員素

20、質(zhì)、衛(wèi)生要求、無菌要求、核對制度以及質(zhì)量監(jiān)督和檢查制度豬瘟免疫失敗的原因有哪些？ 1 沒有按規(guī)定妥善保存和運輸疫苗， 使其免疫原性降低2注射時操作不正規(guī)，劑量不足3生產(chǎn)實踐中免疫程序不合理4 母源性中和抗體對豬瘟弱毒活疫苗的干擾豬瘟疫苗有幾種類型？1豬瘟活疫苗I潴瘟兔化弱毒兔體組織活疫苗2豬瘟活疫苗II豬瘟兔化弱毒犢牛睪丸細胞活疫苗3豬瘟潴丹毒-豬肺疫三聯(lián)活疫苗II號炭疽芽胞疫苗與無莢膜炭疽芽抱疫苗的異同點？1相同點：制苗菌種為炭疽桿菌弱毒C40-202 ,校檢菌種為炭疽桿菌 C40-蝴毒菌株，所選菌株應符合 炭疽桿菌生物學特性，2腰氏度彳存期10a不同點：II號炭疽芽胞疫苗的毒 力應為以3穆

21、氏度培養(yǎng)24h勺普通肉湯培養(yǎng)物0.2m下接種200250g鼠四只，于7d內(nèi)全部死亡或大部死亡；以0.5破下接種體重1.52kg兔2凡 觀察10壞致病，無任何反應。無莢膜炭疽芽胞疫苗的毒力應為以3艱氏度培養(yǎng)24出勺普通肉湯培養(yǎng)物0.25械£下接種小鼠四只，0.5破下接種家兔2只和豚鼠 2 只，均應產(chǎn)生劇烈水腫，但兔不應死亡豚鼠允許死亡 1 只，小鼠應全部或大部死亡，死亡動物脾臟涂片染色鏡檢應不見莢膜。豬丹毒疫苗 有滅活疫苗和活苗兩類，滅活疫苗交互免疫的效果不如活苗。 （一）滅活苗 豬丹毒滅活苗的免疫效果與制苗用菌株的免疫原性有關(guān)， 又與培養(yǎng)基及佐劑的種類有關(guān)。目前應用的有以下三種：氫氧

22、化鋁吸附滅活疫苗、裂解疫苗、豬丹毒豬肺疫氫氧化鋁二聯(lián)滅活疫苗 （二） 弱毒疫苗： 國內(nèi)外關(guān)于培育豬丹毒弱毒菌株的報道很多，但安全和效力可靠的廣泛應用的并不多。 1、豬丹毒 GC42活疫苗2豬丹毒G4T10疫苗.G4T僭毒菌株是江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所與南京獸藥廠協(xié)作，用通過豚鼠致弱的G37菌株通過含0.01儺黃素的血瓊脂培養(yǎng)基傳40代，再提高錐黃素濃度為0.04%繼續(xù)傳10代而培育成的3、豬丹毒- 豬瘟 -豬肺疫弱毒三聯(lián)凍干苗（簡稱豬三聯(lián)苗）口蹄疫，1弱毒疫苗：口蹄疫 O型A型鼠化弱毒疫苗、口蹄疫 O型、A型鼠化弱毒雙價疫苗、2滅活疫苗大腸桿菌 大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起動物， 特別是幼齡

23、動物疾病的總稱。臨床上表現(xiàn)為腹瀉、敗血癥或毒血癥。大腸桿菌病特點：易感動物多，分布范圍廣。血清型多，但在某地或某種動物引起發(fā)病的只有少數(shù)幾個特定血清型。臨床表現(xiàn)類型多。大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性。防治比較困難。分類：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌（SLTEC）腸致 病性大腸桿菌（EPEC）敗血性大腸桿菌（SEPEW道致病性大腸桿菌（UPEC） 豬大腸桿菌1.仔豬黃痢又叫早發(fā)性大腸桿菌病，是出生 1 周內(nèi)仔豬發(fā)生的一種急性、高度致死性的傳染病。以腹瀉（排黃色或黃白色液狀糞便） 、消瘦、迅速死亡為特征。2仔豬白痢又叫遲發(fā)性大腸桿菌病，由致病性大腸桿菌引起.103日0齡仔豬發(fā)生的腸道傳染病。 以排乳白色或灰白色漿狀、 糊狀糞便為特征， 致死率低。3仔豬水腫病由某些溶血性大腸桿菌產(chǎn)生毒素引起斷奶后仔豬的一種過敏性.疾病。其特征是：突然發(fā)病，頭部水腫，共濟失調(diào)，驚厥，麻痹；胃壁和結(jié)腸系膜水腫。炭疽 是由炭疽桿菌引起的一種人畜共患的急性、 熱性、敗血性傳染病。 其特征呈 敗血病變化， 脾臟腫大， 皮下