腫瘤細胞培養(yǎng)

1、第 6 章 腫瘤細胞的培養(yǎng)腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、 抗癌藥的敏感性、 腫瘤細胞和癌分子生物學特性的重要 手段。 癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞， 當前所建立的細胞系中癌細胞是最多的。 應用體外細 胞培養(yǎng)技術(shù)進行腫瘤研究具有許多優(yōu)點：(1) 可免受機體內(nèi)環(huán)境因素的影響，避免了個體差異性，便于探索各種物理、化和生物 因素對腫瘤細胞生命活動的影響。(2) 既便于從細胞水平上研究腫瘤細胞的結(jié)構(gòu)與功能，又便于從基因及分子水平上研究 癌變的發(fā)生機理；(3) 可長期傳代、保存，便于觀察腫瘤細胞生物學特性和遺傳行為的改變。(4) 可用于快速篩選抗癌藥物和研究耐藥機理。(5) 研究周期短，比較經(jīng)濟。但是它也有缺

2、點， 如長期培養(yǎng)可使細胞生物學特性發(fā)生改變； 體外實驗所得的結(jié)果不能 完全代表體內(nèi)的情況，應與體內(nèi)試驗結(jié)合研究更為合理等。一、腫瘤細胞培養(yǎng)的生物學特性1、形態(tài)和性狀 形態(tài)不規(guī)則，細胞界限清晰，伸展較差，核膜、核仁輪廓明顯，核仁多、核漿豐富。折 光性強，電鏡觀察細胞表面微絨毛多而細密， 與腫瘤細胞具不定向運動和鋪著不依賴性有關(guān)。2、生物特性癌細胞在無血清或低血清 (2%5%)時仍能生長，營養(yǎng)要求不高，因能自分泌促增殖因 子，在軟瓊脂培養(yǎng)時單個細胞能形成集落，生長方向性消失， 再加上失去了接觸抑制， 癌細 胞數(shù)量增多時可呈多層重疊生長，細胞飽和密度大，有豐富的三極有絲分裂，分裂指數(shù)高， 細胞倍增周

3、期短。3、永生性永生性也稱不死性，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為可無限制傳代而不凋亡(Apoptosis)，體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系 (株)都表現(xiàn)有這種特性。但體外培養(yǎng)的永生性和體內(nèi)腫瘤的惡性(包括侵潤性 )是兩種性狀， 受不同基因調(diào)控的， 因惡性腫瘤多數(shù)在體外培養(yǎng)時并不那么容易獲得成功，生長增殖能力并不旺盛，有時只能傳若干代，說明體外培養(yǎng)的永生性可在體外培養(yǎng)后獲得的。 另外，體外培養(yǎng)的許多細胞系，如NIH3T3 、 Rat-1 10T1/2 等均具有永生性而無惡性。但兩者有相關(guān)性，永生性可能是細胞惡性變的某一階段。4、侵潤性侵潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為， 體外培養(yǎng)的腫瘤細胞仍保持有這種特性， 當與正常 組

4、織混合培養(yǎng)時，能侵潤入其他正常組織中，甚至能穿透人工隔膜。5、異質(zhì)性 所有腫瘤細胞都是由增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成，屬于異質(zhì)性，其中有的衰老、 退化， 有的處于周期阻滯狀態(tài)， 只有那些處于活躍增殖的腫瘤干細 胞才是支持腫瘤生長的成分， 腫瘤干細胞易于生長增殖， 分離培養(yǎng)干細胞的方法稱干細胞培 養(yǎng)(有干細胞系和數(shù)個亞系組成 )。6、細胞遺傳性失去二倍體核型，呈異倍體或多倍體， 常有標記染色體出現(xiàn)，正常細胞與惡性腫瘤細胞 的區(qū)別，如表6-1所示。表6-1區(qū)別正常成纖維細胞與惡性腫瘤細胞的常用指標指標正常成纖維細胞惡性腫瘤細胞形態(tài)棱形或多角形，伸展良好， 折光較弱，核漿比例

5、小，嗜 堿性弱，核仁較少較小，多 核巨細胞少見多角形或細長形，伸展較 差，折光強，核漿比例大， 嗜堿性強，核仁多、大，常 見多核巨細胞生長特性排列有方向性，單層生長， 有接觸抑制，飽和密度低方向性消失，多層重疊生 長，接觸抑制消失，飽和密 度咼粘附性細胞間粘附性強，緊貼壁生 長細胞間粘附性弱，易脫落血清的要求必須有血清無需血清能生長在半固體瓊脂中生長冃匕力不能生長能生長，形成集落電子顯微鏡觀察核蛋白體較少，微絲微管有 規(guī)則排列核蛋白體豐富，微絲微管消 失細胞膜對低分子物質(zhì)通透性 粘多糖的合成和分泌腺苷酸 環(huán)化酶活性細胞內(nèi)CAMP濃度低 多 高 高高 少 低 低對松孢菌素的反應不刺激核分裂，或至

6、多形成 雙核細胞核持續(xù)分裂，形成多核巨細 胞致瘤試驗不能形成腫瘤能形成腫瘤二、培養(yǎng)腫瘤細胞的生物學特性的檢測體外培養(yǎng)的細胞一旦建立細胞系就需要進行一系列的細胞生物學特性鑒定，其目的在 于：證明培養(yǎng)的細胞是否來自原來的腫瘤細胞。說明腫瘤組織類型。 描述腫瘤細胞的生物學特性。通常要檢查下列項目：1、組織起源應說明培養(yǎng)材料起源于哪個胚層、器官組織、什么樣供體、何種疾病等，必要時要提供病理診斷鑒定資料。2、形態(tài)觀察觀察細胞一般形態(tài)如細胞形狀，核漿比例倒置，有豐富的三極或多極有絲分裂，核仁清晰、多個，微絲、微管排列紊亂。3、細胞生長特點檢測細胞生長曲線，細胞分裂指數(shù)，倍增時間及細胞周期。癌細胞失去正常的

7、接觸抑制， 呈多層生長，生長旺盛，倍增時間縮短，飽和密度大，分裂指數(shù)較高，具無限增殖能力，細 胞浸潤能力較強等。4、軟瓊脂培養(yǎng) 癌細胞在低密度下仍具有高度存活率，并在軟瓊脂中形成集落。5、細胞核型分析 檢測核型特點，染色體數(shù)量，有無標記染色體，染色體帶型等，癌細胞大多為異倍體， 多倍體，并有標記染色體。6、 動物致瘤試驗裸鼠背部皮下接種 1X 1092 X 109/L癌細胞能生長形成實體瘤， 其組 織學形態(tài)與原發(fā)瘤相似。7、組織化學檢查癌細胞中脫氧核糖核酸、 酸性磷酸酶和磷脂增多， 堿性磷酸酶下降， 乳酸脫氫酶和琥珀 酸脫氫酶活性也改變。8、其他生物學特性檢測有凝集試驗等。三、腫瘤細胞的取材和

8、培養(yǎng)（一）腫瘤細胞的取材方法 培養(yǎng)腫瘤細胞的材料一般來自患者，對實體瘤患者可取原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液進行培養(yǎng)。1 、實體瘤取材方法取術(shù)后或活檢標本， 要盡早浸入無血清培養(yǎng)液保鮮， 盡快進行培養(yǎng)。 盡可能去除潰瘍及 壞死組織，避免細菌、霉菌污染，對取自外露的腫瘤組織，應在培養(yǎng)前在含二性霉素B 2卩g/mL，青霉素2001000u/mL，鏈霉素500舊/mL的培養(yǎng)液中浸泡 1020分鐘，再用洗液 反復沖洗干凈后，再作培養(yǎng)。2、體腔液的取材方法在無菌條件下采取體腔液 （胸水或腹水 ），不需加抗凝劑， 可直接以 1200r/min 收集細胞， 不

9、要久置，也不要在冰中冷卻，而應盡早接種。3、血液 （骨髓 ）取材法白血病患者可取血液或骨髓， 主要以取外周血為研究對象， 用肝素抗凝的注射器無菌抽 取 510mL 外周血，置于試管中立刻分離培養(yǎng)。（二）腫瘤細胞的培養(yǎng)方法腫瘤細胞對培養(yǎng)基要求不如正常細胞嚴格， 一般常用 RPM1640， DMEM 、 Mc-Coy-5A 等 培養(yǎng)基，血清濃度不高，10%即可，建議在原代培養(yǎng)時最好能加入生長因子或原患者血清（1% 2%）以利細胞生長，培養(yǎng)方法很多，主要有組織塊法、酶消化法、鉭網(wǎng)法、脫落細胞 法等。原代細胞的培養(yǎng)方法如下：1 、組織塊培養(yǎng)法將取得的瘤組織去除脂肪 結(jié)締組織及壞死部分，在平皿中用 Ha

10、nks液洗3次，剪碎組 織，切成12mm3小塊，接種于事先涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶（或皿）中，37C 5%或加蓋瓶塞在普通恒溫箱中培養(yǎng)。2、酶消化法在上述的碎組織塊中加入 0.25%胰蛋白酶或（2000u/ml膠原酶）在37C水浴中消化30分鐘（或更長一些），去除消化液，用洗液洗 3次，培養(yǎng)液洗1次后，用完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸 管吹打分散制成細胞懸液，計數(shù)。以5X 10810X 10嘰 細胞濃度，在含有10%小牛血清的RPMI1640（或 Eagle MEM 或 DMEM）中 37C 5% CO2下分瓶（或皿）培養(yǎng)。3、鉭網(wǎng)培養(yǎng)法在一張面積約為1cm2的鉭網(wǎng)上放入上述剪碎的一塊或幾塊腫瘤組織塊（1

11、2mm3大?。?用鑷子輕壓，使其粘于網(wǎng)上，再把鉭網(wǎng)放入培養(yǎng)皿中，使網(wǎng)下的組織塊與皿壁緊緊接觸，于 37C 5% CO2下培養(yǎng)，每隔23天換液一次，5天后可見有上皮細胞從網(wǎng)上移出，并能在相 當于腫瘤組織部位形成純凈的單層上皮細胞。3、脫落細胞法將新鮮的腫瘤組織去除脂肪和結(jié)締組織， 洗液洗2次后，用刀片將腫瘤組織切成細薄片， 在切割的同時有許多上皮細胞脫落下來，脫落細胞經(jīng)洗滌后，加入完全培養(yǎng)基，便可獲得較純的上層細胞，于培養(yǎng)瓶 （或皿）中、37C 5% CO2下培養(yǎng)，每隔23天換液，710天上皮 細胞逐漸長成單層。在原代培養(yǎng)中，常在培養(yǎng)物中混有正常成纖維細胞，若把正常細胞誤認為是癌細胞，就會使整個

12、工作失去意義，若不及時去除這些成纖維細胞，由于它比腫瘤細胞生長快，最終能抑制腫瘤細胞的生長。因此，盡早排除成纖維細胞，已成為腫瘤細胞長期培養(yǎng)建系的關(guān)鍵， 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多因素能抑制成纖維細胞生長（見表6-2）。表6-2抑制成纖維細胞生長的因素方法因素組織細胞選擇性附著胰蛋白酶胚胎小腸、心肌表皮膠原酶乳癌選擇性附著底物聚丙稀酰胺各種腫瘤聚四氟乙烯（Teflon）轉(zhuǎn)化細胞膠原（豬皮）表皮細胞匯合飼細胞層小鼠3T3表皮人胎小腸正常和惡性乳腺上皮結(jié)腸癌選擇性培養(yǎng)基D-纈氨酶(Valine)腎組織MCDB-710乳腺MCDB-153表皮Phe nobarbit one肝細胞（三 ）成纖維細胞的排除方法為了

13、在腫瘤細胞中排除成纖維細胞，常采用五種方法，即機械刮除法、反復貼壁法、消 化排除法、膠原酶消化法、密度梯度離心法。1、機械刮除法用不銹鋼絲末端的橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插入不銹鋼絲）或裹上少許脫脂棉制成, 裝入試管中高壓蒸氣滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。程序如下：（1）標記鏡下觀察，用記號筆在培養(yǎng)瓶（皿）的背面圈下腫瘤細胞的部位。（2）刮除 棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶（皿）中，在肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記細胞空間。（3）Hanks液沖洗12次，洗除被刮掉的細胞。(4) 加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至徹底刮凈為止。2、反復貼壁法 根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞

14、貼壁速度慢的特點， 并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液， 把含有 兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離。方法如下(同貼壁傳代 )：(1) 待細胞生長達一定數(shù)量后，倒去舊液，用0.25%胰蛋白酶消化后， Hanks 液洗 2 次，加入不含血清的培養(yǎng)液吹打分散，制成單細胞懸液。(2) 取三個培養(yǎng)瓶分別編號為A、B、C,首先把細胞懸液接種入 A瓶，置溫箱中靜置培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)物，再接種于B瓶中，然后向 A 瓶中補充完全培養(yǎng)基置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。(3) B瓶中的細胞靜置培養(yǎng) 520分鐘后，按處理A瓶的方法，把B瓶中的培養(yǎng)液和細胞 懸液吸出并注入 C瓶中

15、，再向B瓶補加完全培養(yǎng)基，C瓶補加少量小牛血清(濃度為10%)。三個瓶一并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如操作成功，次日觀察，可見A 瓶中主要為成纖維細胞，B 瓶中兩類細胞混雜， C 瓶中主要為上皮細胞 (癌細胞 )，必要時可反復處理幾次直至癌細胞 純化為止。3、消化排除法此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體方法如下：先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后加入新的混合液繼續(xù)消化直到有半數(shù)細胞開始脫落時，立即停止消化。(2) 把消化液離心棄去上清， 沉下的細胞用培養(yǎng)基重懸并吸入另一培養(yǎng)瓶中， 置溫箱培養(yǎng)， 向原瓶中補加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)， 此法處理后， 鑒于成纖維細胞比腫

16、瘤細胞先脫落， 原瓶 中留下的多為腫瘤細胞，經(jīng)過幾次反復處理，就能把成纖維細胞除凈。4、膠原酶消化法 本法是利用成纖維細胞對膠原較為敏感的特點，通過消化進行選擇。(1) 可用 0.5mg/mL 的膠原酶消化處理，邊消化邊在鏡下窺視，當發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉 后即終止消化。(2) 用 Hanks 液洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞，若未清 除凈，可再次重復。5、密度梯度離心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.0251.085 的密度梯度分離液，加入細胞懸液后，2500r/min 離心 10分鐘，在比重 1.0251.050層為成纖維細胞，在比重為1.0651.085層為上皮細

17、胞，將收集的上皮細胞經(jīng)洗液 3次后，進行培養(yǎng)可獲純凈的腫瘤細胞。最近，有人用 SOD 來抑制成纖維細胞的生長，這些方法都需進行預試驗取得經(jīng)驗，找 出適合條件，才能獲得好結(jié)果。(四) 血癌細胞分離培養(yǎng)1 、采血與分離白細胞用肝素抗凝的注射器無菌抽取白血病患者外周血510mL,置無菌離心管中，斜放于37C的水浴中，待紅細胞沉淀后，將血漿部分吸入另一離心管中，以1500r/min離心15分鐘，收集細胞，用含 20%小牛血清的RPMI1640含50u(馮)/mL青、鏈霉素培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1X 109細胞/L以上，開始接種濃度要大。培養(yǎng)基中加入患者血清為1%2%。2、 原代培養(yǎng)物的維持：將分離的患者

18、白細胞種入鏈霉素小瓶中，每瓶3mL在37C溫箱中進行懸浮狀態(tài)的靜置培養(yǎng)，每隔2 3 天半量換一次，吸出 1.5mL 舊液棄去，加入新鮮完全培養(yǎng)基1.5mL。若換液前培養(yǎng)基中的 pH有下降，說明細胞存活，起先一直堅持換液，不 分瓶傳代，直至細胞有明顯增殖再擴大培養(yǎng)。3、傳代培養(yǎng)（直到建系）細胞增殖后， pH 下降明顯時，說明細胞有明顯增殖，此時搖動細胞，在細胞懸液中有 少量細胞結(jié)成的團塊，可轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)，開始以 1:2 分瓶培養(yǎng)，當傳至 10 代左右，細胞開 始生長減慢，幾乎不分裂，甚至有許多細胞死亡，此時再并瓶培養(yǎng)，堅持每3 天換液一次，2 3 周后細胞已適應了外界環(huán)境，開始增殖，然后每 2

19、天換一次液，每周傳一代，即加入 等量培養(yǎng)基以1:2分瓶培養(yǎng)，細胞增殖快時以1:3分瓶，即每瓶加入 6mL，共計9mL，分成3瓶，每瓶3mL，繼續(xù)培養(yǎng)，當傳至 20代以上時已基本穩(wěn)定，可以認為已基本建系，我院 共建了兩個白血病細胞系，即$811粒單型白血細胞系和 S801急性淋巴細胞白血病細胞系。（五）提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率的措施根據(jù)人們的經(jīng)驗， 腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能夠傳代的細胞系更為困難，當腫瘤組織或細胞初代培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：（1）完全無細胞游離出或移動。（2）有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代。（3）傳數(shù)代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停

20、滯期后，才呈現(xiàn)旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生 長的腫瘤傳代細胞系。以上說明： 腫瘤細胞原代培養(yǎng)時對體外生存條件有較高要求， 并需經(jīng)對新環(huán)境適應才能 生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采取特殊的措施。1、適宜底物把純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層或飼養(yǎng)細胞層等。2、生長因子將促進細胞生長因子加入培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)， 常用胰島素、 氫化可的松、雌激素以 及其他生長因子。3、動物體媒介培養(yǎng)為了提高腫瘤細胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應和增加有活力的癌細胞（干細胞 ）的數(shù)量，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后， 再從動物體內(nèi)取出進行培養(yǎng)， 能提高體外培養(yǎng)的成功率， 受體動 物以裸鼠最好。方法如下：（1）瘤塊接

21、種 取新鮮瘤組織，用 Ha nks液洗凈血污，切成13mm3小塊，用穿刺針頭吸 一小瘤塊，于皮下注入瘤塊。（2）待腫瘤生長達較大體積后剝?nèi)〕隽鼋M織。（3）進行體外培養(yǎng)。（4）為防止失敗， 可取部分瘤細胞在裸鼠體內(nèi)傳代， 通過裸鼠媒介接種， 使腫瘤干細胞數(shù) 量增多，細胞易于培養(yǎng)成功。（六）腫瘤細胞體外培養(yǎng)應注意的事項1、在原代培養(yǎng)時應注意的問題(1) 培養(yǎng)材料應取自腫瘤細胞集中、 活力較好的部分， 取材后應立即培養(yǎng)并存放于培養(yǎng)液 中。(2) 取材和培養(yǎng)過程中要防止細菌和霉菌污染。(3) 培養(yǎng)物中混有的成纖維細胞要盡快清除。(4) 癌組織中若有淋巴細胞浸潤， 應采用密度離心法將淋巴細胞清除， 否則

22、癌細胞會被殺 死。(5) 實驗要防止其他細胞株的交叉污染。2、在傳代腫瘤細胞培養(yǎng)時應注意的問題(1) 當癌細胞沒有生長到足夠的量時，應耐心等待，堅持換液，不要急于傳代。(2) 癌細胞經(jīng)常重疊生長， 如果混有成纖維細胞， 應在傳代時采用消化消除法及反復貼壁 法加以清除，分離出癌細胞進行傳代培養(yǎng)。(3) 在傳到 10 代前細胞生長繁殖極不穩(wěn)定，傳代要小心，該合并培養(yǎng)時還得合并，千萬 不能傳代。要確定適合該細胞的培養(yǎng)方法。(4) 在早期傳代時要適當提高接種濃度。(5) 對于增殖能力極低的細胞， 應放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)， 并加入一些促生長物質(zhì)， 如胰島素、 氫化考的松、雌激素、 EGF 、軟鐵蛋白等因子。(6) 消除成纖維細胞始終為癌細胞培養(yǎng)中的重要條件，一旦發(fā)現(xiàn)應盡早盡快按上述介紹的方法加以清除。(七) 人類惡性腫瘤連續(xù)性細胞系 (株)的建系 (株)標準1、共同特征能在體外培養(yǎng)半年以上 (或20代以上)，生長穩(wěn)定， 保持特性，能連續(xù)傳代的，可稱為連 續(xù)性細胞系 (株 )。要具備如下原始資料：(1) 標本來源 要記錄患者姓名、年齡、性別、臨床診斷的疾病類別和分期。(2) 標本收集日期、細胞制作培養(yǎng)日期和方法。(3) 標本的病理切片和病理診斷，按組織學類型診斷。(2)形態(tài)觀察 光鏡觀察 觀察活細胞與染色細胞的