探討不同中藥復(fù)方對(duì)禽流感病毒感染模型小鼠的影響

1、探討不同中藥復(fù)方對(duì)禽流感病毒感染模型小鼠的影響摘要：【目的】觀察不同中藥復(fù)方對(duì)禽流感病毒感染模型小鼠的影響?！痉椒ā窟x用BALB/C小鼠，隨機(jī)分為藿香正氣散組（藿香組，劑量為26 4 g kg-1 d -1）,桂枝湯組（劑量為13 6 gkg-1 d -1）,桑菊飲組（劑量為34 4 g kg-1 d-1），病毒唑組（劑量為70 mg- kg-1 d-1）,模型組，尿囊液對(duì)照組（尿 囊液組）。各組按設(shè)計(jì)劑量給藥3次后，以100卩L正常尿囊液滴入尿囊液組小 鼠鼻腔，其他各組小鼠以100卩L H5N1禽流感病毒滴鼻，復(fù)制禽流感小鼠模型。 觀察各組小鼠一般情況，體溫、體質(zhì)量變化，死亡保護(hù)率及肺指數(shù)。

2、【結(jié)果】模型組小鼠體溫顯著下降（P桂枝湯 桑菊飲。模型組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P桂枝湯 藿香正氣散。3組中藥復(fù)方均可延長模型小鼠的存活時(shí)間，死亡保護(hù)作用強(qiáng)弱依 次為桂枝湯 藿香正氣散桑菊飲。模型組肺指數(shù)顯著升高（P關(guān)鍵詞：藿香正氣散/藥理學(xué)；桂枝湯/藥理學(xué)；桑菊飲/藥理學(xué)；禽流感/中藥療法；疾病模型，動(dòng)物； 小鼠流行性感冒屬于中醫(yī)時(shí)行感冒和風(fēng)溫的范疇。H5N1禽流感病毒所致的流行性感冒對(duì)全世界造成一定的危害，有必要研究傳統(tǒng)中藥復(fù)方對(duì)新型禽流感的防治療效，為預(yù)防禽流感提供新的手段。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：H5N1禽流感病毒感染小鼠后，病 邪由表入里迅速傳變，病情急驟,發(fā)熱過程不明顯，機(jī)體功能迅速下降，主要

3、表現(xiàn) 為體溫下降、納差，甚者不能進(jìn)食、消瘦、腹瀉、衰竭死亡等。本研究經(jīng)過中藥 復(fù)方篩選預(yù)試，選擇了對(duì)胃腸型感冒和暑瘟有治療作用的藿香正氣散，對(duì)體溫、免疫、胃腸道等功能具有雙向調(diào)節(jié)作用的桂枝湯以及治療風(fēng)熱感冒初期的桑菊飲，觀察3種中藥復(fù)方對(duì)H5N1禽流感病毒感染BALB/C小鼠的干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法I I毒株A/Goose/Guangdong/NH/20XX（H5N1）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究 室惠贈(zèng)并經(jīng)中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定。I 2雞胚912 d齡發(fā)育良好的SPF雞胚,由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技 術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK京 NOXX 0001 0丨3雞紅細(xì)胞（RB

4、C）健康雄雞靜脈血于生理鹽水 4C保存,用生理鹽水洗滌, 配成體積分?jǐn)?shù)1%勺R(shí)BC懸液。I 4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用110只1822 g的SPF級(jí)BALB/C小鼠許可證號(hào)： SCXKg）2（曲 0002L雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 經(jīng)5%隨機(jī)抽 樣符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn),并排除禽流感病毒（AIV）的自然感染,且無抗AIV的抗體產(chǎn)生。選用Co60滅菌飼料，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK粵0002：。本實(shí)驗(yàn)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所的負(fù)壓感染實(shí)驗(yàn)室 使用 許可證號(hào)：SYXK粵001 y中進(jìn)行,動(dòng)物飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中,接毒及取材 在生物安全柜中操作。丨5主要實(shí)驗(yàn)儀器3電腦數(shù)字式體溫計(jì)

5、由歐姆龍（大連）有限公司提 供,JJ200型電子天平由常熟雙杰測(cè)試儀器廠提供，BS124S電子天平由北京賽多 利斯儀器系統(tǒng)有限公司提供，DK 8D型電熱恒溫水槽由上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠提 供JG 6 ff微量高速離心機(jī)由長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司提 供JidC I300ilA/B3生物安全柜由蘇凈集團(tuán)安泰公司提供。丨6藥物藿香正氣散（藿香10 g、紫蘇葉5 g、白芷5 g、大腹皮5 g、茯 苓5 g、白術(shù)6 g、半夏曲6 g、陳皮6 g、厚樸6 g、桔梗6 g、炙甘草6 g）、 桂枝湯（桂枝9 g、芍藥9 g、甘草9 g、生姜9 g、大棗3枚）、桑菊飲（桑葉15 g、菊花10 g、杏仁10 g、桔

6、梗10 g、連翹10 g、薄荷10 g、蘆根15 g、甘草 6 g）處方藥材均購自廣州健民醫(yī)藥連鎖有限公司。病毒唑（利巴韋林）,批號(hào)：08045102,由廣東省藥品檢驗(yàn)所提供。劉忠華，等.不同中藥復(fù)方對(duì)禽流感病毒感染模型小鼠的影響第3期丨7動(dòng)物分組將110只BALB/c小鼠分為6組：藿香正氣散組（簡稱藿香組,劑量為 26 寥賂1 d-1）,桂枝湯組（劑量為To 6 g kg-1 d-1）,桑菊飲組（劑量 為別 彳gkg-1 d-1）,病毒唑組（陽性藥物對(duì)照,劑量為70 mg - kg-1 d -1）, 模型對(duì)照組（簡稱模型組）,尿囊液對(duì)照組（簡稱尿囊液組）。接毒前2 d,各組小鼠 每天分別灌胃

7、給藥，接毒當(dāng)天上午給藥，下午將100卩L H5N1禽流感病毒小鼠 半數(shù)致死劑量（MLD50）為100 6朗/1±用移液槍滴入各組小鼠鼻腔,尿囊液組小 鼠滴入100卩L正常尿囊液。接毒后正常飼養(yǎng)，供給飼料量為標(biāo)準(zhǔn)日糧，高壓滅菌 水足量供給，雌雄分籠飼養(yǎng)。丨8觀察指標(biāo)丨8丨臨床癥狀觀察各組呼吸、精神狀況、毛色、雙耳、四肢和尾巴色 澤、行為活動(dòng)、糞便、飲食、體質(zhì)量等變化。丨8 2體溫變化采用電子體溫計(jì)測(cè)量肛溫，接毒前5 d每天1次，接毒后 12 h測(cè)1次,以后每天1次,連續(xù)9 d。3死亡情況記錄接毒后各組小鼠出現(xiàn)死亡的時(shí)間，計(jì)算死亡率及死p死亡=N死亡/N總數(shù)X 100%,p死亡保護(hù)=（N

8、總數(shù)-N死亡）/N總數(shù)1 8亡保護(hù)率：4肺指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量各組小鼠肺質(zhì)量和體質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)和 肺指數(shù)抑制率：I肺=川肺/m體,p肺指數(shù)抑制=（1肺,模型組-I肺,給藥組）/1肺,X 100%1 8模型組X 100%1 9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,采用單變量 方差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用X 2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平 E 05。2結(jié)果2 1臨床癥狀小鼠在接毒后第2天出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，皺毛，弓背，食 欲下降及呼吸急促，愛扎堆，蜷縮，豎毛，顫抖；第37天出現(xiàn)死亡，部分小鼠出現(xiàn) 腹瀉，尿囊液組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。藿香組、桂枝湯組、桑菊飲組、病毒唑組 小

9、鼠于接種后的第45天出現(xiàn)明顯臨床癥狀，模型組于接種后第3天出現(xiàn)明顯臨 床癥狀,第6天模型組小鼠全部死亡。2 2各組體溫變化表1結(jié)果顯示：接毒后第1天至第9天,各組小鼠體溫均 顯著下降,與尿囊液組比較差異均有顯著性意義（P桂枝湯 桑菊飲，其中藿香組 作用更佳,第57天體溫與病毒唑組比較差異均有顯著性意義（P桂枝湯 藿香正 氣散。第45天,藿香組、桂枝湯組、桑菊飲組與模型組比較，差異均有顯著性 意義（P桂枝湯藿香正氣散。表4結(jié)果顯示：藿香組、桂枝湯組死亡保護(hù)率升高，與病毒唑組比較差異均 有顯著性意義卩。2 5各組小鼠肺指數(shù)表5結(jié)果顯示：模型組肺指數(shù)顯著升高（卩1）旣藿 香組、桂枝湯組、桑菊飲組肺指

10、數(shù)顯著降低，與模型組比較差異均有顯著性意義 （卩1）旣），且3組肺指數(shù)抑制率均高于病毒唑組。表 1各組小鼠體溫變化比較 （X ± S）表2各組小鼠體質(zhì)量變化表3各組小鼠每天死亡保護(hù)率表4各組小鼠死亡 保護(hù)率比較表5各組小鼠肺指數(shù)比較3討論禽流感是由A型流感病毒引起的家禽或野禽的一種感染和/或疾病綜合征。 李志東等建立了禽流感ICR小鼠模型。我們?cè)谶M(jìn)行中藥防治實(shí)驗(yàn)前也研究了禽流 感病毒感染BALB/C小鼠后出現(xiàn)體溫下降、體質(zhì)量減輕、腹瀉、納差甚者不能進(jìn) 食，病程明顯,死亡率高的模型特點(diǎn)。其中體溫下降可能與麻醉或動(dòng)物種類有關(guān)。 因?yàn)槭侨斯そ佣?，大量禽流感病毒同時(shí)進(jìn)入呼吸道和肺臟，急性起病

11、,發(fā)熱就可能 發(fā)生在接毒的24 h內(nèi),而這時(shí)受麻醉降溫影響，無法檢測(cè)到體溫升高的變化。 Dybing等報(bào)道，將禽流感病毒接種到BALB/c小鼠引起小鼠體溫降低,與本實(shí)驗(yàn) 禽流感病毒感染小鼠后測(cè)得體溫下降相似。我們將禽流感病毒感染猴后，也表現(xiàn)為發(fā)熱癥狀,與Lois等報(bào)道禽流感在雪貂身上復(fù)制并引起發(fā)熱和Rimmelzwaan等5-6報(bào)道禽流感引起食蟹猴發(fā)熱相似。研究表明7-13:藿香正氣散可通過祛邪培中治療 AIV感染小鼠所導(dǎo)致的 正氣不足及體溫下降。桑菊飲中的桑葉有抗菌、抗病毒作用，連翹對(duì)流感和副流 感病毒有抑制作用。桂枝湯對(duì)體溫的雙向調(diào)節(jié)能使?fàn)I衛(wèi)不和所致的體溫升高或偏 低的病理狀態(tài)趨向正常，而

12、且對(duì)腸道功能、免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，能顯著抑 制亢進(jìn)的腸蠕動(dòng)，也能使受抑的腸蠕動(dòng)活動(dòng)增強(qiáng)。桂枝含揮發(fā)油，其成分主要為桂 皮醛等，對(duì)流感病毒有抑制作用。藿香中的黃酮類化合物具有抗病毒生長增殖的 作用，陳皮苷能預(yù)防流感病毒的感染。本研究結(jié)果顯示：用中藥干預(yù)的模型小鼠推遲1 d出現(xiàn)明顯臨床癥狀，藿香 正氣散對(duì)模型小鼠的體溫保護(hù)效果最明顯，其次是桂枝湯和桑菊飲，病毒唑?qū)η?流感感染小鼠的體溫?zé)o保護(hù)作用。藿香正氣散、桂枝湯、桑菊飲的干預(yù)均能減緩 模型小鼠體質(zhì)量降低，對(duì)模型小鼠均有保護(hù)作用，死亡保護(hù)率由高到低依次是桂 枝湯、藿香正氣散、桑菊飲。藿香組、桂枝湯組、桑菊飲組、病毒唑組肺指數(shù)抑 制率均為正值

13、，表明給藥組動(dòng)物的肺病變程度較模型組輕，且3組中藥復(fù)方減輕 肺臟病變的作用較病毒唑更佳。綜上所述,藿香正氣散、桂枝湯、桑菊飲對(duì)禽流感均具有一定的防治作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】李培生.傷寒論講義M.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985 : 67.李志東,劉忠華,黃韌，等.禽流感H5N1亞型病毒感染ICR小鼠的動(dòng)物模型 J.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),20XX, 16(2):91.Dybing J K,Schultz C S,Swa yn ede,et p athoge nesis oflIongKong origin II5N1 vi mses in nni ce pared T.o th ar. of orher

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15、0XX,75(14):6687.RimmelzwaanG F,Kuiken T,Amerongen G,et primatemodel to study thep athoge nesis of in flue nza A (H5N1) virus in fectio nJ.Avia nDiseases,20XX, 47(S3):931.富杭育,周愛香,查顯元,等.桂枝湯對(duì)體溫雙向調(diào)節(jié)作用機(jī)理的探討一一對(duì) 下丘腦前列腺素E含量的影響J.中西醫(yī)結(jié)合雜志,1991,11(1):34.霍海如,譚余慶,李曉芹,等.桂枝湯有效部位A()對(duì)體溫雙向調(diào)節(jié)作用及其 機(jī)理研究一一對(duì)下丘腦前列腺素 E含量的影響J.中國實(shí)驗(yàn)方劑 學(xué),1998,4(2) :25.富杭育,郭淑英,高英杰,等.桂枝湯對(duì)體溫雙向調(diào)節(jié)作用的探討一一對(duì)下丘 腦乙酰膽堿Ach和去甲腎上腺素NE含量的影響J.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，1996,2(2):8.富杭育,周愛香,郭淑英,等.桂枝