體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)

1、1 .體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)1.1 目的要求1 .把握血漿樣品的前處理方法。2 .熟悉方法回收率和萃取回收率實(shí)驗(yàn)操作和評(píng)判。3 .熟悉大鼠眼眶采血技術(shù)；熟悉方法學(xué)研究中其他評(píng)判內(nèi)容。L2要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器山奈酚(Kaempferol)及其對(duì)比品,黃苓素(baicalein),抗壞血 酸，肝素，0-葡萄糖醛酸苜酶(-glucuronidase)和硫酸酯酶(sulfatase), 分析純甲醇，冰醋酸、無水乙醛，色譜純乙厝；高效液相色譜儀，氮 吹裝置，恒溫水浴，漩渦混合器，13000r/min臺(tái)式離心機(jī)，不同規(guī)格 移液槍(5,20,50, 100,200, lOOOpL)和容量瓶(10, 25mL), 5

2、10mL具塞離心管若干;雄性SD大鼠(180220g)。山奈酚13實(shí)驗(yàn)原理山奈酚吸取進(jìn)入體內(nèi)后，多以二相代謝物葡萄糖醛酸苜和硫酸酯 的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苜和硫酸酯的對(duì)比品難以獲得, 故采納加入硫酸酯和葡醛酸苜水解酶處理樣品，使代謝物水解后測(cè)定 仃元山奈酚的濃度。實(shí)驗(yàn)以黃苓素為內(nèi)標(biāo)，HPLC法測(cè)定血漿中山奈 酚濃度，對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)判。1-4實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜條件：C18柱（250mmx4.6mm, 5pm）,配愛護(hù)柱，柱溫40；乙脂-0.5%冰醋酸（35:65）為流淌相,流速ImL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)370nm；進(jìn)樣量20|iL。2 .溶液配制：取山奈酚對(duì)比品約2.5mg,周

3、密稱定，置25mL量 瓶中，用甲醇溶解并定容。周密吸取適量，分不用甲醇稀釋成0.3、 0.6、3、6、9、20和30pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置4冰箱儲(chǔ)存。另 取黃苓素適量，周密稱定，用甲醇溶解并定量稀釋至0.1mg/mL的溶 液，周密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，得內(nèi)標(biāo)溶液，置 4冰箱儲(chǔ)存。3 .血漿樣品處理：取大鼠血漿樣品120|.iL,加入甲醇20pL、1% 冰醋酸（含2mg/mL抗壞血酸）32HL、。-葡萄糖醛酸甘酶（20U/mL） 和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50pL, 37c水浴溫育30min后, 加入內(nèi)標(biāo)溶液50|.iL,然后加無水乙酸2mL,漩渦混合5mi

4、n,于 12000r/min離心5min；取上清液在氮?dú)饬飨聯(lián)]干，殘留物用100皿 甲醇復(fù)溶，12000i7min離心5min,取上清液進(jìn)樣分析。4 .專屬性考察：取空白血漿、添加山奈酚與內(nèi)標(biāo)的空白血漿、血 漿樣品，按“血漿樣處理”項(xiàng)下方法處理，照“色譜條件”項(xiàng)下方法進(jìn)樣 測(cè)定。比較所得色譜圖，考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾測(cè)定，藥物及 內(nèi)標(biāo)是否達(dá)到基線分離。若有必要，適當(dāng)調(diào)整色譜條件，已達(dá)到專屬 性要求。5 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：周密吸取120PL大鼠空白血漿9份，分不加入 20PL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，制得0.0（空白）、0.0（空白+內(nèi)標(biāo)）、0.05. 0.1、0.5、1.5、3和5pg/mL的

5、山奈酚血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液（每個(gè)濃度 點(diǎn)平行35份）。按“血漿樣品處理”項(xiàng)下自“加1%冰醋酸32匹”起, 同法處理后進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以山奈酚與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（R）對(duì)山奈酚血漿濃度（C）進(jìn)行線性回來（兩個(gè)空白不計(jì)入回來 曲線，僅作為對(duì)干擾的考察），求得回來方程（R=bC+a）和相關(guān)系數(shù) （r）。并取各濃度點(diǎn)實(shí)測(cè)值代入回來方程得回來值（C）,與標(biāo)示值（C） 比較，運(yùn)算偏差（偏差=1*100% ）和準(zhǔn)確度（準(zhǔn)確度= C7Cxl00%）o依照上述結(jié)果確定線性范疇與定量下限（LLOQ）。6 .回收率和周密度試驗(yàn)：周密吸取120pL大鼠空白血漿，分不加 入不同濃度的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制低、中、高（0.1、

6、1、4pg/mL） 三種濃度的山奈酚血漿樣品，每濃度點(diǎn)平行5份，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備” 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理、測(cè)定。將山奈酚與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出測(cè)得濃度。運(yùn)算測(cè)得濃度與加入濃度的比值，得方法回收率，并 運(yùn)算各濃度點(diǎn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）,作為日間周密度；于不同日（至 少3d）重復(fù)上述測(cè)定，運(yùn)算日間周密度。7 .萃取回收率試驗(yàn)：周密吸取120PL大鼠空白血漿，分不加入不 同濃度的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制0.1, 1和4pg/mL濃度的山奈酚血漿 樣品，每濃度點(diǎn)平行5份，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記 錄山奈酚峰和內(nèi)標(biāo)峰面積，作為萃取后的測(cè)定值。另取上述低、中、 高同樣濃度的山奈酚甲醇

7、液，加同樣量?jī)?nèi)標(biāo)溶液，混合，直截了當(dāng)于 氮?dú)饬飨聯(lián)]干，殘留物用100卜工甲醇復(fù)溶，12000r/min離心5min, 取同樣量上清液進(jìn)樣分析，獲得山奈酚峰和內(nèi)標(biāo)峰面積，作為未萃取 的測(cè)定值。采納外標(biāo)法運(yùn)算萃取后山奈酚峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)萃 取的山奈酚峰面積比值，得山奈酚萃取回收率；同法運(yùn)算內(nèi)標(biāo)的萃取 回收率。8 .穩(wěn)固性實(shí)驗(yàn)：周密吸取12O|1L大鼠空白血漿，按“回收率和周 密度試驗(yàn)項(xiàng)下方法配低、中、高濃度的山奈酚血漿樣品。考察其在 室溫下放置24h （6, 12, 24h取樣）、-20下長(zhǎng)期凍存1個(gè)月（10, 20, 30d取樣）、反復(fù)凍融（-20C室溫）3次的穩(wěn)固性，將測(cè)得結(jié) 果與0時(shí)的

8、結(jié)果進(jìn)行比較，運(yùn)算RSDo并考察測(cè)定溶液的穩(wěn)固性， 即樣品制備后到進(jìn)樣分析的放置時(shí)刻（6, 12, 24, 36, 48h）的穩(wěn)固 性。9 .血漿樣品測(cè)定：將山奈酚按1 mg / kg的劑量尾靜脈給予禁食 12h的SD大鼠，于給藥前（Omin）和給藥后5、10、15、30、45、 60、90、120、180、240min 分不從眼眶采 0.4mL 血，8000r / min 離 心5min,分離血漿。按“血漿處理方法”項(xiàng)下方法處理后，在HPLC 上進(jìn)樣分析，記錄峰面積。將山奈酚與內(nèi)標(biāo)峰而積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線, 運(yùn)算血漿中山奈酚的濃度，繪制藥-時(shí)曲線。1.5 注意事項(xiàng)1 .山奈酚和內(nèi)標(biāo)多為多羥基化

9、合物，對(duì)光、熱不穩(wěn)固，測(cè)定時(shí)應(yīng) 注意避光操作。2 .大鼠眼眶采血容易操縱采血的時(shí)刻周期，采血質(zhì)量高，而且不 受是否尾靜脈注射給藥的阻礙，故這種采血方法相對(duì)優(yōu)于尾靜脈注 射。3 .當(dāng)線性范疇較寬時(shí)，宜采納加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回來運(yùn)算，以 使低濃度結(jié)果較正確。LLOQ偏離標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)W20%,其他各點(diǎn)偏離 標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)W 15%, 1蕓0.09.山奈酚和內(nèi)標(biāo)的萃取回收率應(yīng)接近，差 異不超過10%。1.6 參考文獻(xiàn)田楊,蔣學(xué)華，楊平，等.HPLC測(cè)定大鼠血漿中山奈酚.華西藥學(xué)雜志, 2018,23(3):357.2 HPLC-MVIS法測(cè)定人尿中左氧氟沙星濃度2.1 目的要求1.1 握尿樣測(cè)定的前處理方法

10、。1.2 握LC-MS測(cè)定中基質(zhì)效應(yīng)和專屬性的考察方法。1.3 悉LC-MS分析中質(zhì)譜條件的選擇。2.2 要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器鹽酸左氧氟沙星膠囊(0.1g或0.2g),左氧氟沙星(levofloxacin) 和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)對(duì)比品，色譜純甲醇、甲酸，分析純醋 酸鐵；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，氮吹裝置，恒溫水浴，漩渦混合器， 不同規(guī)格移液槍(5, 20, 50, 100, 200, lOOOpL)和容量瓶(10, 25mL), 10ml具塞離心管若干。2.3 實(shí)驗(yàn)原理以環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，建立尿中左氧氟沙星的LC-MS / MS測(cè)定方 法，著重考察方法的專屬性和基質(zhì)效應(yīng)，選擇最佳色

11、-質(zhì)條件。質(zhì)譜 測(cè)定方法采納多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)方式。2.4 實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜和質(zhì)譜條件：色譜柱為C8柱(100mmx2.1mm, 3.5pm)； 甲醇-1 mmol / L醋酸銹溶液-甲酸(35： 65： O.O1)為流淌相，流速0.25mL /min；進(jìn)樣量IOiiL。電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式，多反應(yīng) 離子監(jiān)測(cè)(MRM)的MS掃描方式，左氧氟沙星和內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星的檢測(cè) 離子對(duì)劃分不為 362.2318.2 和 332.2-288.20 (m/z)； MS 參數(shù)： 毛細(xì)管電壓5.5kV,加熱溫度400。2 .標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取約5mg左氧氟沙星對(duì)比品，周密稱定，置 25mL量

12、瓶中，用甲醇溶解并定容，周密吸取適量，用甲醇分不稀釋 成5、10、25、50、100、150、250和500陽(yáng)/ mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液, 置4冰箱儲(chǔ)存。取5mg環(huán)丙沙星，周密稱定，置25mL量瓶中，用 甲醇溶解并定容。取適量用甲醇稀釋成200pg/mL,即得內(nèi)標(biāo)溶液, 置4冰箱儲(chǔ)存。3 .尿樣處理：取1mL人尿液樣品，加入lOpL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2mL水（依照實(shí)測(cè)濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)，同時(shí)考察調(diào)整后的基質(zhì)效應(yīng)）, 混勻，用0.45pm孔徑的偏氟膜過濾，取10皿濾液進(jìn)樣分析。4 .專屬性考察：取人空白尿樣、添加左氧氟沙星和內(nèi)標(biāo)的空白 尿樣、健康受試者口服鹽酸左氧氟沙星膠囊后的尿樣（加內(nèi)標(biāo)），按“尿 樣

13、處理”項(xiàng)下自“再加入2mL水”起，依法處理后，在選定的條件下進(jìn) 樣分析，比較三者圖譜，考察方法專屬性。必要時(shí)對(duì)色譜、質(zhì)譜條件 作適當(dāng)調(diào)整。5 .基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)判：取人空白尿液1.0mL,加入2.0mL水，混 勻,用0.45pm孔徑的偏氟膜過濾得濾液。在濾液中分不加入不同濃 度的左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終濃度分不為0.5, 1.5和4pg/mL 每濃度點(diǎn)平行3份。另用純水代替空白尿液，同法操作。將上述溶液 分不進(jìn)樣測(cè)定，獲得相應(yīng)的峰面積。以同濃度下兩種不同處理方法的 樣品峰面積（A ,/A水）的比值來評(píng)判基質(zhì)效應(yīng)。6 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：周密量取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10pL,置 氮?dú)饬飨聯(lián)]干，周密加

14、入人空白尿液1.0mL,漩渦混合，制成濃度分 不為0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5和5k值/ mL的氧氟沙星尿液 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每濃度點(diǎn)平行2份。按“尿樣處理”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣 分析，記錄峰面積。以左氧氟沙星與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對(duì)左氧氟沙星 尿樣濃度進(jìn)行線性回來，得回來方程。7 .尿液樣品的測(cè)定：健康男性理想者單劑量口服0.10.2g鹽酸 左氧氟沙星膠囊，在服藥前和服藥后不同時(shí)刻段收集尿液,記錄體積。 按“尿樣處理”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。將左氧氟沙 星與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)算尿藥濃度。2.5 注意事項(xiàng)1 .尿液要緊成分是水、尿素、鹽類，易長(zhǎng)細(xì)菌，

15、宜4冷藏或 加防腐劑。2 .左氧氟沙星要緊以原型自腎排泄，在體內(nèi)代謝甚少?？诜?8h 內(nèi)尿中排出量約為給藥量的80%90%。尿中濃度隨給藥量變化而變 化，尿中達(dá)峰時(shí)刻約為2h,可先進(jìn)行預(yù)試，依照尿中實(shí)際濃度，調(diào) 整尿液稀釋倍數(shù)。3 .不同型號(hào)的LC-MS儀、色譜柱，測(cè)定條件可能有較大差異， 需要進(jìn)行優(yōu)化。2.6 參考文獻(xiàn)施愛明，潘杰，張全英，等. LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中左氧氟沙 星濃度.藥學(xué)進(jìn)展，2018,32(5):228.3 GC-MS法測(cè)定大鼠肝臟組織中鹽酸克倫特羅濃度3.1 目的要求1 .把握固相萃取法的原理和方法。2 .熟悉組織樣品的前處理方法。3 .熟悉GC-MS質(zhì)譜條件的

16、選擇。3.2 要緊實(shí)驗(yàn)器材與儀器鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride)樣品和對(duì)比品，分析純 雙甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA),甲醇、甲苯、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧 化鈉、碳酸鈉等。GC-MS聯(lián)用儀、渦旋混合器、恒溫干燥箱、高速 冷凍離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、陽(yáng)離子交換萃取小柱。SD大鼠（180220g）。鹽酸克倫特羅3.3 實(shí)驗(yàn)原理利用鹽酸克倫特羅的堿性，采納碳酸鈉堿性條件下使鹽酸克倫特 羅游離，用有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取。然后在有機(jī)相中加入稀鹽酸酸化, 使克倫特羅離子化而溶于酸水中，進(jìn)一步采納陽(yáng)離子交換固相小柱去 除雜質(zhì)。再與BSTFA衍生化，用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。3.4 實(shí)

17、驗(yàn)方法1 .色譜和質(zhì)譜條件：GC色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱 （30mx0.25mmx0.25pm）；程序升溫：初始柱溫 70c （保持 Imin）, 以20chiin升至180C （保持Imin）,以54nin升至220 （保持 2min）,以 25/inin 升至 260 （保持 2min）；進(jìn)樣口溫度 280C；不 分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量l.OpL；載氣高純He： LOmLdnin。EI源，源溫度 200；傳輸線溫度280；電離電壓為70eV；四級(jí)桿溫度160； 測(cè)定方式為全掃描和選擇離子檢測(cè)，條件如下：03.5min為溶劑延遲 時(shí)刻,3.5 15.0min，全掃描范疇（m/z50刻00），監(jiān)

18、測(cè)離子（m/z86）,15.Omi n最后，關(guān)閉燈絲。2 .標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：周密稱取lOmg鹽酸克倫特羅于100mL量瓶 中，用甲醇定容至刻度，得鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后用甲醇配 制0.5、1、5、15、制和200pMnL濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。3 .組織樣品的處理（1）稀酸提?。喝〈笫蟾闻K約1g，周密稱定，加水5mL,勻漿, 在勻漿液中加入20mL乙酸乙酯（定量轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中），再 加入15%碳酸鈉溶液2 mL,超聲15min后，于高速冷凍離心機(jī)上以 6000r / min離心5min,收集上層有機(jī)相,再加入10 mL乙酸乙酯于 離心管中，超聲提取15min后，收集合并有機(jī)相。在收

19、集的有機(jī)相中 加入0.2mol / L的稀鹽酸溶液2mL,旋渦混合后，于5000r / min離 心5min,吸取下層水相，重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取的水相，用 稀NaOH溶液調(diào)劑pH至5.5。（2）陽(yáng)離子交換萃取小柱凈化:將陽(yáng)離子交換小柱依次通過5mL 甲醇、5mL水和5mL 20mm01/L稀鹽酸活化，然后將處理好的稀酸 提取液上樣至小柱，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗柱子，抽干小柱, 再用5mL5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液5mL的刻度試管中。（3）衍生化：洗脫液與50水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，周密加?00pL 的甲苯和lOOpL的BSTFA,充分旋渦混合30s,在80的烘箱中加 熱衍生lh （

20、反應(yīng)容器加蓋蓋緊）。衍生完畢待冷卻后轉(zhuǎn)移入進(jìn)樣品 中，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。4 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分不取大鼠空白肝臟1g,加水5mL,勻漿, 在勻漿液中分不加入不同濃度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液10卜工，使勻 漿液中終濃度分不為5, 10, 50, 150, 500和2000ng/g組織,混勻。 照“組織樣品處理”項(xiàng)下自“在勻漿中加入20mL乙酸乙酯”起，依法進(jìn) 行稀酸提取、陽(yáng)離子交換萃取小柱凈化和衍生化處理，GC-MS測(cè)定。 以鹽酸克倫特羅濃度對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回來，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。5 .樣品測(cè)定：取鹽酸克倫特羅樣品，按50pg/kg給藥劑量灌胃給 予SD大鼠。在給藥后lh,處死大鼠。肝臟以生理

21、鹽水灌流，并用濾 紙吸干水分。周密稱取肝組織1g,按“組織樣品處理項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè) 定。將獲得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)算肝組織中鹽酸克倫特羅的濃 度。3.5 注意事項(xiàng)固相萃取小柱使用前需要進(jìn)行活化，一樣先用甲醇，再用水沖洗。 關(guān)于陽(yáng)離子或陰離子交換小柱還需用酸或堿進(jìn)一步活化。3.6 參考文獻(xiàn)1王紅.氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物肝臟組織中鹽酸克倫特羅.中 國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007,17(8):1409.2吳銀良，李曉薇，楊挺，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝臟組織中鹽 酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺.分析化學(xué)，2006,34(8):1083.4 原子吸取分光光度法測(cè)定頭發(fā)中鋅含量4.1 目的要求1.1 .把握消

22、化法處理生物樣品的方法。1.2 悉原子吸取分光光度法檢測(cè)原理和方法。1.3 要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器色譜純鋅，優(yōu)質(zhì)純硝酸，分析純鹽酸、高氯酸、氨水。原子吸取 分光光度計(jì)、鋅空心陰極燈、電熱板1.4 實(shí)驗(yàn)原理采納硝酸-高氯酸對(duì)頭發(fā)進(jìn)行消解處理，使微量鋅以金屬離子狀 態(tài)轉(zhuǎn)入溶液溶液，用原子吸取分光光度法測(cè)定。樣品溶液進(jìn)入火焰后, 待測(cè)元素的基態(tài)原子吸取來自同種元素空心陰極燈發(fā)射的共振線，其 吸取強(qiáng)度在一定范疇內(nèi)與待測(cè)元素濃度成正比，采納標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行 定量。1.5 實(shí)驗(yàn)方法1 .儀器參數(shù):檢測(cè)波長(zhǎng)213.9nm；光譜通帶0.40.8nm；燈電流 34mA；空氣流量56L/min；乙烘流量IL/min；火

23、焰高度612mm。2 .鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取金屬鋅1g,周密稱定，置200mL燒杯 中，加入6moi/L鹽酸溶液3040mL,使鋅溶液，待溶解完全后，加 熱煮沸數(shù)分鐘，冷卻，定量轉(zhuǎn)移至1000mL量瓶中，用蒸儲(chǔ)水稀釋至 刻度，搖勻，即得濃度為Img/mL的鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；周密移取10mL 鋅儲(chǔ)備液于100mL量瓶中，用蒸儲(chǔ)水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度 為lOOpg/niL的鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液；周密移取10mL鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL量 瓶中，用蒸儲(chǔ)水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為10Mg/niL的鋅標(biāo)準(zhǔn) 溶液。3 .樣品處理（1）發(fā)樣洗滌：取頭發(fā)0.3g左右，用剪刀剪成12cm的小段,置50mL燒杯中，用5

24、%氨水（pH置8.08.5）浸泡30min,用自來水 漂洗34次，再用二次去離子水沖洗45次，置于65c烘箱中干燥 4h,取出后放入干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＃?）消化處理：取通過洗滌處理的頭發(fā)0.2g,周密稱定，置于 100mL燒杯中，加入5mL濃硝酸，蓋上表面皿，在電熱板上加熱消 解，待完全溶解后取下，冷卻至室溫，加入高氯酸1mL,再在電熱板 上連續(xù)加熱，冒白煙至溶液剩余12mL時(shí)（切不可蒸干）取下，冷 卻后加入適量蒸儲(chǔ)水，定量轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，并用水稀釋至刻 度，搖勻待測(cè)。同時(shí)按相同步驟制備1份空白溶液。4 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：周密吸取濃度為10pg/mL的鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液0, 2, 4, 6,

25、8, 10mL,分不置于6個(gè)100mL量瓶中，用1%高氯酸溶 液稀釋至刻度，搖勻。于213.9nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，以濃度對(duì)吸 光度值做線性回來，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。5 .樣品測(cè)定：取頭發(fā)適量（3份），按“樣品處理”項(xiàng)下方法操作, 照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定條件測(cè)定樣品溶液的吸光度，將測(cè)得的吸光度值代入 標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)算供試液中鋅濃度，并依照頭發(fā)取樣量求得發(fā)樣中鋅含 量（pg/g）o1.6 注意事項(xiàng)1 .本實(shí)驗(yàn)采納硝酸-高氯酸消解法對(duì)頭發(fā)進(jìn)行處理，這是濕法有 機(jī)破壞的常用消解液，其破壞力強(qiáng)，適用于生物樣品的破壞，所得無 機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)。由于硝酸和高氯酸均具有氧化性，破壞反應(yīng)猛 烈，切勿將溶液蒸干，以免爆炸。

26、消化操作應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。2 .乙煥(燃?xì)?-空氣(助燃?xì)?流量比對(duì)鋅測(cè)定有較大阻礙， 應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)選擇。此外，光譜通帶、燈電流、火焰高度等均對(duì)測(cè)定有 一定阻礙，需要進(jìn)行選擇。1.7 參考文獻(xiàn)1黃高超，孫林超.人體頭發(fā)中鋅含量分析研究.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué) 刊,2007,11:87.2馬威，袁英賢.原子吸取法測(cè)頭發(fā)中鋅含量的方法探討.河南 科學(xué),2003,21(6):722.3張桂文.原子吸取光譜法測(cè)定兒童頭發(fā)中鋅含量.遼寧化工， 2018,38(10):770.5雙氯芬酸鈉的生物利用度5.1目的要求1.1 握藥物生物利用度測(cè)定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理方法。1.2 握大鼠眼眶采血技術(shù)和常用給藥技術(shù)。1.3

27、要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)，布洛芬(ibuprofen),肝素,色譜純甲醇，分析純KH2PO4； 13000r/min離心機(jī)，高效液相色譜儀;SD 雄性大鼠(180220g)。ONaCL布洛芬1.4 實(shí)驗(yàn)原理用甲醇沉淀血漿蛋白，以布洛芬為內(nèi)標(biāo)，HPLC法測(cè)定大鼠血漿中雙氯芬酸鈉濃度。依照靜脈注射給藥和灌胃給藥的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (AUC)和給藥劑量(D)運(yùn)算雙氯芬酸鈉的生物利用度。1.5 實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜條件：分析柱為Ci8(250mmx4.6mm, 5pm)；流淌相為甲 醇-20mmol/LKH2PC)4溶液(pH 3) (50： 50)；檢測(cè)波長(zhǎng) 282

28、nm；進(jìn) 樣量20gLo2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取雙氯芬酸鈉適量,用甲醇配制出濃度為Img /mL的儲(chǔ)備液,然后用甲醇稀釋至200, 100, 50, 10, 5, 2和1線 /mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取布洛芬適量，用甲醇溶解并稀釋制成 濃度為20MgiiiL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取空白大鼠血漿100pL,分不加入上述雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液10gL 和布洛芬溶液1011,混勻，再加入250HL甲醇溶液，混勻，在 10000必nin下離心10min,取上清液20|iL進(jìn)樣測(cè)定。將雙氯芬酸鈉 的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與雙氯芬酸鈉濃度進(jìn)行線性回來，獲得 標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 .血樣采集：取SD雄性大鼠12只，隨

29、機(jī)分成2組，將其中一組 按20mg / kg的給藥劑量灌胃給藥，另一組按2mg / kg的給藥劑量尾 靜脈注射給藥。分不在給藥前和給藥后5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360和480min,眼眶取血250pL,置于肝素離心管中,5000r /min離心，取100卜1血漿，4放置備用。4 .樣品分析：取大鼠血漿樣品IOOlL,加入內(nèi)標(biāo)溶液lOpL,加入 甲醇260gL,混勻,在10000r / min離心10min,取上清液20gL進(jìn) 樣。將雙氯芬酸鈉與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，運(yùn)算相應(yīng)的 濃度。5 .數(shù)據(jù)分析：灌胃給藥和靜脈注射給藥各大鼠不同時(shí)刻

30、點(diǎn)的血藥 濃度按表1和表2填寫。采納藥動(dòng)學(xué)分析軟件DAS2.0運(yùn)算藥物動(dòng)力 學(xué)參數(shù)。并按以下公式運(yùn)算生物利用度：生物利用度F=Ax X100% AU Civ 0 Po1.6 注意事項(xiàng)1 .運(yùn)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的軟件有專門多,如3P97, DAS2.0等。 可依照實(shí)驗(yàn)室己有的軟件進(jìn)行運(yùn)算。開始運(yùn)算前，需保證時(shí)刻和濃度 的單位一致。在進(jìn)行運(yùn)算時(shí)，有兩種擬合模型，分不是房室模型和統(tǒng) 計(jì)電巨模型。當(dāng)采納房室模型擬合時(shí)，可能顯現(xiàn)同一組動(dòng)物數(shù)據(jù)中顯現(xiàn) 不同房室模型的情形，使數(shù)據(jù)處理顯現(xiàn)偏差。因此，常用的擬合模型 為統(tǒng)計(jì)矩模型。2 .靜脈注射組開始幾個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的樣品濃度有可能超出標(biāo)準(zhǔn)范疇 的上限，顯現(xiàn)這種情形時(shí)

31、，應(yīng)將樣品用空白大鼠血漿稀釋后測(cè)定。表1灌胃給藥各大鼠不同時(shí)刻點(diǎn)的血藥濃度(gg/niL)時(shí)刻鼠號(hào)(min)1234565101530表2靜脈注射給藥大鼠不同時(shí)刻點(diǎn)的血藥濃度(pg/rnL)時(shí)刻鼠號(hào)(min)12345651015301.7 參考文獻(xiàn)lLeon-Reyes MR,Castaneda-Hernandez G, Ortize ML Pharmacokinetic of declofenac in the presence and absence of glibenclamide in the rat. J Pharm Pharmaceut Sci 2018,12(3):280.2

32、Musmade P, Subramanian Q Srinivasan KK, High-performance liquid chromatography and pharmacokinethcs of aceclofenac in rats.Analytical Chmica Acta.2007, 585:103.6.血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定6.1 目的要求1 .把握超濾法測(cè)定蛋白結(jié)合率的方法。2 .熟悉實(shí)驗(yàn)條件的考察與選擇。6.2 要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器龍膽苦昔(gentiopicroside, GPS),正常人血漿,色譜純甲醇， 分析純磷酸鹽；超濾管(10k),可控溫高速離心機(jī)，Eppendor

33、 (EP) 離心管，高效液相色譜儀；昆明種小鼠。6.3 實(shí)驗(yàn)原理將龍膽苦甘與人血漿混合，平穩(wěn)一段時(shí)刻，取其中一部分通過超 濾管，分不測(cè)定血漿中龍膽苦甘總濃度和超濾管中龍膽苦甘游離濃 度，運(yùn)算血漿蛋白結(jié)合率。6.4 實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜條件：C.柱;流淌相為甲醇-水(28:72),流速ImL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)274nm；進(jìn)樣量20pL。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取干燥至恒重的GPS對(duì)比品約25mg,周密 稱定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為 Img/mL的對(duì)比品儲(chǔ)備液。周密吸取儲(chǔ)備液1mL于10mL量瓶中，力口 pH7.4的磷酸鹽緩沖液至刻度。再周密量取0.05, 0.1, 0

34、.2, 0.5, 1.0, 2.0mL于25mL量瓶中，加pH7.4的磷酸鹽緩沖液至6mL,加甲醇至 刻度,得濃度為0.2, 0.4, 0.8, 2, 4, 8啥mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,搖 勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回來， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。3 .超濾管吸附性試驗(yàn)：取GPS標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（Img/mL）適量，用 PH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度為1, 5和10Mg/niL的溶液，分不 取500j.iL置超濾管中，于4000i7min下離心25min （離心機(jī)溫度設(shè)為 37）o分不取超濾管和未離心溶液100匹,各加入300PL甲醇,旋 渦混合30s, 16000i7min離心

35、15min,取上清液過微孔濾膜，取20|iL 續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。運(yùn)算超濾管吸附性。假如超濾管對(duì)藥物吸附過多，應(yīng)對(duì)超濾管進(jìn)行測(cè)定溶液飽和處 理。方法如下：取上述吸附性試驗(yàn)項(xiàng)下低、中、高3種濃度溶液各 1mL,置超濾管中飽和24h,棄去溶液，用濾紙將超濾管中殘液吸干, 然后再進(jìn)行吸附試驗(yàn)。4 .血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)：分不周密吸取Img/mL的GPS對(duì)比品 儲(chǔ)備液0.5, 2.5, 5.0mL于25mL量瓶中，加pH7.4的磷酸鹽緩沖液 至刻度，得到濃度為20, 100和200iig/mL的GPS溶液。分不周密吸 取3種濃度的GPS溶液50PL于EP管中,加入人血漿950pL,漩渦 混合平均，置

36、于37c水浴平穩(wěn)4h,移取500pL,置超濾管中（若有 必要對(duì)超濾管進(jìn)行飽和處理），于4000r/min離心25min （離心機(jī)溫度 設(shè)為37）,取超濾液100卜工，照“血漿中龍膽苦甘總濃度測(cè)定”方法 操作，將測(cè)得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得超濾液中GPS濃度。同 時(shí)測(cè)定血漿中龍膽苦苜總濃度。5 .血漿中龍膽苦甘總濃度測(cè)定：精確吸取lOOpL血漿，加入 300|.iL甲醇，旋渦混合30s, 16000r/min離心15min,取上清液過微 孔濾膜，取20HL續(xù)濾液進(jìn)樣分析。6 .血漿蛋白結(jié)合率運(yùn)算：依照超濾液中GPS濃度（pD和血漿中 GPS總濃度（P2）,按下列公式運(yùn)算龍膽苦存血漿蛋白結(jié)合率：

37、血漿蛋白結(jié)合率=（P1-P2/P2）X100%6.5 注意事項(xiàng)1 .超濾法是利用半透膜原理對(duì)游離藥物和結(jié)合藥物進(jìn)行分離，設(shè) 備簡(jiǎn)單、操作方便，其最大優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)血漿中游離藥物的快速分離， 僅十幾分鐘至數(shù)十分鐘即可收集到足夠供測(cè)定的血漿超濾液。但此法 也存在一定弊端：分離過程中結(jié)合平穩(wěn)不穩(wěn)固；對(duì)高蛋白結(jié)合率 藥物的游離濃度難以準(zhǔn)確檢測(cè)；結(jié)合藥物在透過濾膜時(shí)會(huì)顯現(xiàn)泄 漏；超濾裝置對(duì)藥物具有吸附性。因此，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先考察超濾管對(duì) 龍膽苦甘的吸附性，必要時(shí)對(duì)結(jié)合反應(yīng)的溫度、pH值等因素進(jìn)行考 察。2 .溫度考察：血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)溫度一樣為4和37,按“血 漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)”項(xiàng)下方法配制GPS低、中、高3

38、個(gè)濃度（1、5、 lOgg/mL）的樣品溶液，分不置37水浴和4冰箱中，于0、1、2、 3、4h取樣測(cè)定濃度，考察不同溫度下GPS穩(wěn)固性，選擇血漿蛋白結(jié) 合率試驗(yàn)的適合溫度。3 .龍膽苦昔在pH7.4緩沖溶液中的穩(wěn)固性考察：取龍膽苦苜標(biāo)準(zhǔn) 儲(chǔ)備液適量，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為25pg/mL的溶 液，在室溫下放置2、4h,分不取20HL測(cè)定峰面積，與。時(shí)峰面積 比較，考察龍膽苦甘在pH7.4溶液中的穩(wěn)固性。6.6 參考文獻(xiàn)1王長(zhǎng)虹，王崢濤.超濾法測(cè)定龍膽苦甘的血漿蛋白結(jié)合率.中國(guó) 藥學(xué)雜志,2005,40(3):232.2王立,任君剛.超濾法測(cè)定表沒食子兒茶素沒食子酸酯人血漿 蛋白

39、結(jié)合率,中國(guó)藥學(xué)雜志，2018,43(20):1579.3趙淑紅，蔣袁絮,高亦瓏，等.家兔血漿中龍膽苦甘濃度的高效 液相色譜測(cè)定.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2018,21(5):1131.7木犀草素的離體腸吸取實(shí)驗(yàn)7.1目的要求1.1 握離體腸吸取實(shí)驗(yàn)原理與運(yùn)算方法。1.2 悉離體外翻腸囊法實(shí)驗(yàn)操作。1.3 要緊實(shí)驗(yàn)器材與儀器Krebs-Ringer緩沖液，木犀草素(luteolion)，色譜純甲醇,分析純磷酸；高效液相色譜儀，恒溫水浴鍋；SD大鼠(180220g)。OHOHHOOH 0木犀草羲1.4 實(shí)驗(yàn)原理外覷腸囊K氏液含藥K氏液 通氧氣管 恒溫水浴圖16 1離體外翻腸囊裝置示意圖采納離體外翻腸囊法，

40、將一段（515cm）大鼠小腸外翻，使腸 粘膜朝外，漿膜朝內(nèi)，腸的一端結(jié)扎，另一端插入一套管后用線扎緊。 通過套管往腸囊內(nèi)充盈一定量K氏液，并將腸囊浸在一定體積的K 氏液（含有一定濃度的木犀草素）中。通過套管于不同時(shí)刻點(diǎn)吸取漿 膜側(cè)溶液進(jìn)行測(cè)定，分析藥物透過腸道情形。支持管蟹料管一氣體出口1.5 實(shí)驗(yàn)方法L色譜條件:分析住為J8柱；流淌相為甲醇-0.2%磷酸溶液(50:50),流速為 LOniL/inin,檢測(cè)波長(zhǎng)為 350nm。2 . Krebs-Ringer緩沖液（K氏液）的配制：取0.37gCaCk和 0.22gMgCl2,加入適量的水超聲使溶解,再依次加入7.52g NaCl, 0.35

41、g KC1, 0.29g NaH2Po42H2O, 1.37g NaHCCh 和 L4g 葡萄糖，溶解混勻 后，加入水定容至1000mL。再用l.Omol / L的H3Po4調(diào)齊U pH至6.8, 備用（臨用新奇配制）。3 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取木犀素適量，周密稱定，用甲醇配置成Img /mL的溶液，4儲(chǔ)存。取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用K氏液稀釋，制成含 木犀草素 0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 1.5, 2.0 和 4.0pg/mL 的溶液。分不 取20iiL進(jìn)樣，測(cè)得峰面積。以木犀草素濃度對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線 性回來，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。4 .腸段的選取和外翻腸囊的制備：選取健康SD大鼠，頸動(dòng)脈放 血

42、處死，開腹腔暴露出小腸，在離幽門15cm處取空腸段，去除腸系 膜。用37CK氏液洗凈，剪取空腸前段10cm,將一端結(jié)扎，用圓頭 玻璃棒小心的將腸段翻轉(zhuǎn)，使腸粘膜層在外，漿膜層在內(nèi)，放入K 氏液中洗凈，用濾紙吸干粘膜表面液體。在腸囊內(nèi)放入取樣細(xì)軟管后 用線扎緊，通過取樣細(xì)軟管，用刻度注射器往腸囊內(nèi)充盈定量的K 氏液。5 .樣品的采集和測(cè)定：將預(yù)備好的腸囊放入定量（一樣50mL） 裝有K氏液（含10gg / mL木犀草素）的錐形瓶中，往瓶中通入含 5%CCh的氧氣，并置于37c的水浴鍋中保溫。于不同的時(shí)刻點(diǎn)（0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2h）,通過采樣細(xì)軟管采集0.2mL腸囊內(nèi)液體

43、， 并同時(shí)快速補(bǔ)充等量新奇K氏液。取樣完畢后精確測(cè)定腸囊的表面 積。采納建立的HPLC法測(cè)定樣品中木犀草素峰面積，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲 線運(yùn)算相應(yīng)的濃度。6 .結(jié)果運(yùn)算：運(yùn)算單位表面積木犀草素的累積吸取量(ng/cm2), 并以累積吸取量-時(shí)刻作曲線。以腸囊內(nèi)t時(shí)刻點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)刻進(jìn) 行回來，得方程LnC=A+Kat能夠求得目標(biāo)成分在大鼠腸囊的吸取 速度常數(shù)(Ka)。并運(yùn)算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficients, Papp)0Papp=x A X (Co + Ct nd) - 2 At7.5注意事項(xiàng)1 .離體腸吸取屬于急性離體實(shí)驗(yàn)，清洗步驟中在去除腸內(nèi)容物

44、的 同時(shí)專門可能降低了腸內(nèi)多種酶系的活力，外翻的過程也可能對(duì)腸管 的組織結(jié)構(gòu)有一定的阻礙，因此操作必須在冰浴中進(jìn)行，盡可能幸免 腸段的機(jī)械性損害。2 .離體腸吸取法作為一種離體藥物吸取的模型，在有機(jī)培養(yǎng)液， 如K氏液中，能使小腸在60min內(nèi)保持較強(qiáng)的活性，2h后離體腸段 失活，因此實(shí)驗(yàn)必須在2h內(nèi)完成。3 .一樣藥物在K氏液中溶解度較差，因此能夠使用DMSO等增 溶劑，但增溶劑含量必須小于3.0%。，否則會(huì)使腸段加速失活。4 .往含藥的K氏液錐形瓶中通入含5%CO2的氧氣時(shí)，必須先通 過緩沖裝置，否則氣流大小難以操縱，容易造成液體外濺。5 .采集樣品后往腸囊內(nèi)補(bǔ)充的等量新奇的K氏液的溫度必須

45、是 37,并幸免氣體注入腸囊。采集腸囊內(nèi)藥液時(shí)，內(nèi)部軟細(xì)管口應(yīng)離開腸壁，幸免損害或戳破腸壁。8.地西泮的體外代謝試驗(yàn)8.1 目的要求1 .把握藥物體外代謝實(shí)驗(yàn)原理和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的運(yùn)算方法。2 ,熟悉體外代謝反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇。8.2 要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器地西泮(diazepam, M=284.74) ,N-去甲地西泮(nordiazepam,M=270.74)，氯硝西泮(clonazepam, M=315.72),鼠肝微粒體，還原型煙酰胺腺喋吟二核甘酸磷酸(NADPH, M=833.35), Tris-HCl緩沖液，色譜純乙睹；高效液相色譜儀。N 去甲地西泮8.3 實(shí)驗(yàn)原理地西泮與鼠肝微粒體重藥

46、酶作用，產(chǎn)生中間活性代謝物N-去甲 地西泮。孵育反應(yīng)完成后用乙酸乙酯提取兩者，以氯硝西泮為內(nèi)標(biāo)， 采納HPLC法測(cè)定地西泮和N-去甲地西泮的含量。依照底物剩余量 或產(chǎn)物生成量運(yùn)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。8.4 實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜條件:分析柱為G8柱(150mmx4.6mm, 5pm)；流淌相 為乙靖-O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液(pH3) (60:40),流速ImL/min；檢 測(cè)波長(zhǎng)254nmo2 .溶液配制(1) NADPH 溶液配制：取 NADPH3.3mg,用 l%NaHCCh溶液 稀釋成200叱，制成20mmol/L的NADPH溶液，4放置備用(宜臨 用新配)。(2 ) Tris-HCl溶液

47、配制：取Tris-HCl和MgCb適量，加蒸儲(chǔ)水 適量使溶液，用HC1調(diào)劑pH值至7.4,再用蒸儲(chǔ)水稀釋至Tris-HCl 和MgCb的濃度分不為01和0.015mol/L的溶液，4c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3)樣品溶液配制：取地西泮和N-去甲地西泮適量，周密稱定, 分不用DMSO溶解并稀釋制成地西泮濃度為10, 20, 50, 100, 200, 300, 500mmol/L 的溶液，N-去甲地西泮濃度為 1,5, 10, 20, 50, 100 mmol/L 的溶液。另取氯硝西泮適量，周密稱定，用DMSO稀釋至濃度為 的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。以上溶液均于4放置備用。3 .樣品處理：取lOOpL孵育后微粒

48、體溶液，加入10卜工內(nèi)標(biāo)溶液, 混勻，在沸水浴中放置30s,再加入1.0mL乙酸乙酯溶液，渦旋提取 2min,在5000min離心5min,將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至另一 Ep離心管 中，至氮?dú)饬飨聯(lián)]干，殘留物用100匹 流淌相溶解，10000r/min離心 lOmin,取上清液20PL進(jìn)樣測(cè)定。4 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取空白失活微粒體適量，用Tris-HCI溶液稀釋 到1000NL,使微粒體蛋白濃度為Img/mL,分不加入上述不同濃度的 地西泮和N-去甲地西泮lpL,使地西泮和N-去甲地西泮的濃度分不 為 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500Hmol/L 和 1, 5, 10,

49、20, 50, 100（.imol/L,混勻，按“樣品處理”項(xiàng)下方法操作。將樣品峰面積與內(nèi) 標(biāo)峰面積比值與相應(yīng)的樣品濃度進(jìn)行線性回來，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。5 .酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：取微粒體適量，用Tris-HCI溶液稀釋到 lOOOpL,使微粒體蛋白濃度為Img/mL,分不加入IpL不同濃度的地 西泮溶液，使其終濃度分不為10, 20, 50, 100, 200, 300, 500gmol/L, 混勻，每濃度點(diǎn)平行3份。37預(yù)孵育5min,分不加入NADPH溶 液101工啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)30min后，在沸水浴中放置30s終止反應(yīng)， 按“樣品處理”項(xiàng)下方法操作。分不運(yùn)算地西泮的剩余濃度以及N-去 甲地西泮

50、的生成濃度。利用非線性回來方程（Lineweaver Burk或 Eadie-Hofstee方程），以地西泮濃度對(duì)其排除速率或N-去甲地西泮生 成速率作圖，分不運(yùn)算米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)濃度Vmax值。8.5 注意事項(xiàng)1 .親酯性藥物常用有機(jī)溶劑做溶劑，往微粒體孵育液中加底物溶液時(shí)，為保證酶活性，加入有機(jī)溶劑量應(yīng)不超過孵育反應(yīng)總體積的0.5%o酶和NADPH在高溫時(shí)均容易失活，故孵育反應(yīng)前，微粒體及 各種試劑均應(yīng)置冰浴中儲(chǔ)存。2 .所用酶濃度和孵育時(shí)刻需要優(yōu)化，酶濃度和孵育時(shí)刻在線性 范疇內(nèi)要求底物濃度被代謝量低于20%。在酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，底物濃 度應(yīng)取1/33倍Km值范疇，并至少取6個(gè)濃度

51、水平，每個(gè)濃度需平 行做3份，取平均值運(yùn)算。3 .采納底物地西泮的排除量運(yùn)算獲得的K”值與采納產(chǎn)物N-地 西泮的生成量運(yùn)算獲得的Km值不相同。這是因?yàn)橐缘孜锱懦窟\(yùn)算 的Km值反映的是鼠肝微粒體中所有能催化地西泮一相代謝的酶的總 活性，而以N-去甲地西泮的生成量運(yùn)算獲得的Km值針對(duì)的是其中能 代謝地西泮生成N-去甲基代謝物的酶的活性。8.6 參考文獻(xiàn)1匡唐永，樓雅卿.應(yīng)用中國(guó)成人肝微粒體研究地西泮代謝.中國(guó) 藥理與毒理學(xué)雜志，1995,9(2):81.2劉菊芳，張遠(yuǎn).血漿中去甲地西泮及代謝物奧沙西泮的HPLC 測(cè)定方法和大鼠口服藥代動(dòng)力學(xué).藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995,30 (9)： 655.9對(duì)乙酰氨

52、基酚代謝物的LCMS鑒定9.1目的要求1 .把握LC-MS / MS法鑒定代謝產(chǎn)物的方法。2 .熟悉大鼠血管膽管插管的操作方法。3 .2要緊實(shí)驗(yàn)材料與儀器對(duì)乙酰氨基酚（paracetamol）,分析純CMC-Na,色譜純甲醇、 甲酸、甲酸鍍；LC-MS聯(lián)用儀，大鼠代謝籠、手術(shù)臺(tái)。4 .3實(shí)驗(yàn)原理收集服藥大鼠的尿液和膽汁，用LC-MS / MS法檢測(cè)。通過總離 子流掃描，提取底物和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，獲得各種代謝產(chǎn)物 的分子量，再采納子離子掃描法進(jìn)一步確證代謝物。對(duì)乙酰氨基酚的 代謝途徑見圖：9.4實(shí)驗(yàn)方法1 .色譜和質(zhì)譜條件：分析柱為Cm柱（150mmx4.6mm, 5國(guó)n）；流淌相為含0

53、.1%甲酸的10mmol/L甲酸鈉溶液（A）-甲醇（B）,采 納梯度洗脫方式,20min內(nèi)（A ）相從95%線性下降至30%；流速0.5mL / mino MS條件：電噴霧(ESI)離子源，毛細(xì)管電壓1.5kV,源溫 度350C,正離子電離模式，采納全掃描模式和子離子掃描模式檢測(cè)。2 .灌胃給藥溶液的配制：取對(duì)乙酰氨基酚適量，用1%的CMC-Na 溶液研磨，配制成6mg / mL的溶液。3 .樣品采集與處理(1)尿樣采集：按60mg / kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，并將 大鼠放在代謝籠中，自由飲水。在給藥前和給藥后6h內(nèi)分不收集尿 樣。4儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)膽汁采集：用乙酸將大鼠麻醉，并將四肢固定

54、于手術(shù)臺(tái)上, 打開腹腔，進(jìn)行膽管插管。收集0.5mL左右空白膽汁。然后按60mg /kg的給藥劑量灌胃給予大鼠，連續(xù)收集膽汁，4儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3)樣品處理：取適量尿液和膽汁，用蒸鐳水1:1稀釋，并加 入2倍體積的甲醇，渦旋，用0.2pm偏氟膜過濾，收集濾液備用。4 .樣品分析(1)全掃描分析：對(duì)上述樣品進(jìn)行分析，獲得全掃描總離子流 圖，離子掃描范疇為100500m/z。采納離子提取的方法，提取底物 和各代謝產(chǎn)物的分子離子峰，分不為對(duì)乙酰氨基酚151.2,谷胱甘肽 結(jié)合物456.5,硫酸結(jié)合物231.2,葡醛酸結(jié)合物327.3, 3-羥基對(duì)乙 酰氨基酚167.2, 3-甲氧基對(duì)乙酰氨基酚181.2

55、。9.5注意事項(xiàng)1 .膽汁和尿液中存在大量的無機(jī)鹽以及一些蛋白類物質(zhì)。無機(jī)鹽 的濃度過高可能導(dǎo)致嚴(yán)峻的基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此需要稀釋后進(jìn)樣。另 外，能夠通過加入蛋白質(zhì)沉淀劑去除蛋白，常用的為加入甲醇或乙靖 等有機(jī)溶劑。2 .膽管插管的方法，最好是先找到胃，向下找到十二指腸乳頭部, 再往肝臟方向找，能發(fā)覺韌帶樣的組織，中間有一根專門細(xì)的白管， 有時(shí)是嫩黃色的，這確實(shí)是膽管，用鏡柄墊在下方，用另一只尖鏡子 小心的剝離脂肪組織，只要分理處半厘米長(zhǎng)度就足夠插管了，注意分 離好后用手術(shù)線系住近腸端，方便固定，然后再剪一個(gè)小口，導(dǎo)管插 口也要注意剪成斜面，如此便于插管。3 .以上色譜和質(zhì)譜條件只是一種參考，不同的色譜柱和不同型號(hào) 的LC-MS,它們的最佳分析條件不同，因此，在進(jìn)行代謝產(chǎn)物