化妝品中地索奈德等十一種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法編制說(shuō)明

1、化妝品中地索奈德等十一種糖皮質(zhì)激素的液相色譜/串測(cè)定質(zhì)譜法編制說(shuō)明聯(lián)(征求意見(jiàn)稿)一、工作簡(jiǎn)況1任務(wù)來(lái)源本項(xiàng)目是根據(jù)國(guó)標(biāo)委發(fā)201911號(hào)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)第一批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì) 劃的通知進(jìn)行制定，計(jì)劃編號(hào)為20190950-T-469,項(xiàng)目名稱為“化妝品中地索奈德等十一種糖皮 質(zhì)激素的測(cè)定液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法",主要起草單位有廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院等，計(jì)劃應(yīng)完成時(shí)間為2020年12月。2主要工作過(guò)程(1) 起草階段2019年4月，廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院按照全國(guó)質(zhì)量監(jiān)管重點(diǎn)產(chǎn)品檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化 技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC374)的要求成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，并制訂了標(biāo)準(zhǔn)研制計(jì)劃。

2、2019年4月-2019年8月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組進(jìn)行了大量的研究分析、資料查證及方法確認(rèn)等 工作，初步設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案。2019年9月2020年4月，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室大量相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，重點(diǎn)研究 成分復(fù) 雜的洗面奶類樣品的基質(zhì)效應(yīng)去除方法，優(yōu)化確定色譜分離條件和質(zhì)譜檢測(cè)條件，優(yōu)化確定液態(tài)水基 類、液態(tài)油基類、凝膠類、膏霜乳液類等類型化妝品的提取、凈化條 件，考察方法的靈敏度、準(zhǔn)確 性、線性范圍和適用性，編制標(biāo)準(zhǔn)草案和編制說(shuō)明，組織3家有資質(zhì)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，提 交SAC/TC374化妝品檢驗(yàn)方法工作二組進(jìn)行審核，根據(jù)審核意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)一步修改，形成標(biāo)準(zhǔn) 的征求意見(jiàn)稿。(2) 征求意見(jiàn)

3、階段(3) 審查階段(4) 報(bào)批階段3主要參加單位和工作組成員等本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位為廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院等。工作組主要成員：XXXo、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要內(nèi)容(一)標(biāo)準(zhǔn)編制原則 本標(biāo)準(zhǔn)的制定符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原則。本著先進(jìn) 性、科學(xué)性、合理性和可操作性的原貝嘰以及標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范 性原則來(lái)進(jìn)行本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則和 GB/T 20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)的要求編寫的。本標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)性和再現(xiàn)性按GB/T 6379.1-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確

4、度與精密 度）第1部分：總則與定義和GB/T 6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度） 第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性的基本方法進(jìn)行確定。（二）標(biāo)準(zhǔn)研制背景對(duì)我國(guó)現(xiàn)行糖皮質(zhì)激素藥物的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)以及科技文獻(xiàn)資料進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)近年 來(lái)關(guān)于糖皮 質(zhì)激素藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法及液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法等，主要應(yīng)用于化妝品、食品領(lǐng)域的相關(guān)檢測(cè)。其中液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法是我國(guó)GB/T 24800.2-2009化妝品 中四十一種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法和薄層層析法、SN/T2533-2010進(jìn)出口化妝品中糖皮質(zhì)激素類與孕激素類檢測(cè)方法、SN/T 4504-

5、2016出口化妝品 中氯倍他索、倍氯米松、氯倍他索丙酸酯的測(cè)定液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布面膜類化妝品中氟輕松檢測(cè)方法的通告（2016年第88號(hào)）附 件：面膜類化妝品中氟輕松檢測(cè)方法（高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法）采用的標(biāo)準(zhǔn)方 法。以上四個(gè)方法 標(biāo)準(zhǔn)共涉及44種糖皮質(zhì)激素，然而，隨著國(guó)家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)涉及糖皮質(zhì)激素的監(jiān)管力度不斷加大，不法企 業(yè)為了使產(chǎn)品具有明顯短期功效的同時(shí)又能規(guī)避市場(chǎng)監(jiān)管，近年來(lái)開(kāi)始通過(guò)化學(xué)合成設(shè)計(jì)等手段，將 某些功效較好的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成新型糖皮質(zhì)激素，摻入化妝品原料中生產(chǎn)使用，對(duì)消 費(fèi)者的合法權(quán)益和健康造成了一定危害。廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院多年來(lái)

6、通過(guò)采用液相色譜四極桿 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)不斷深入對(duì)化妝品中糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)的篩查研究。通過(guò)質(zhì)譜解析，篩查并鑒 定出實(shí) 際化妝品中地索奈德等11種現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法外的糖皮質(zhì)激素。綜上可見(jiàn)，現(xiàn)行的檢測(cè)方法 標(biāo) 準(zhǔn)已無(wú)法全面覆蓋時(shí)下不法企業(yè)可能添加的糖皮質(zhì)激素種類，因此，針對(duì)地索奈德等11種已在實(shí)際 化妝品中檢出的新型糖皮質(zhì)激素（其中3種已新增至國(guó)家藥監(jiān)局2019年第66號(hào)文件所發(fā)布的“化妝品中激素類成分的檢測(cè)方法"中）建立檢測(cè)方法，可有效補(bǔ)充現(xiàn)行檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)覆蓋范圍不能 滿足市場(chǎng)監(jiān)管的不足，為強(qiáng)化化妝品的安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。（三）主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化妝品中地索奈德、16。輕基潑

7、尼松龍、16。輕基潑尼松龍醋酸酯、二 氟拉松、 氟輕松、去輕米松、帕拉米松醋酸酯、地索奈德 f 醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸 丙酸酯、鹵倍他索 丙酸酯和倍他米松丁酸丙酸酯11種糖皮質(zhì)激素的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS ）測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化妝品中地索奈德等11種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定。1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化1.1精油類化妝品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化精油類樣品不能很好分散于極性提取劑中，因此采用正己烷分散后再用極性溶劑進(jìn) 行提取的方 法。對(duì)比了 80%乙月青水溶液、70%乙月青水溶液、50%乙月青水溶液三種提取劑對(duì) 精油樣品中11種 糖皮質(zhì)激素的提取效果。具體試驗(yàn)方法為：稱取0.2 g樣品于10 mL塑料

8、離心管中（制備平行樣品）,加入標(biāo)準(zhǔn)溶液至 加標(biāo)濃度為0.2卩g/g混勻。加入2mL正己烷，渦旋分散均勻后，加入3mL提 取劑，渦旋振蕩2 min /以10 000 r/min離心5 min，吸出下層溶液至10 mL比色管中，上層正己烷用3 mL提取劑重 復(fù)提取一次，合并兩次提取液，加50%乙月青水溶液定容至刻度，混勻，取適量溶液經(jīng)0.22卩有機(jī) 濾膜過(guò)濾，待測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，70%乙月青水溶液對(duì)精油樣品中11種糖皮質(zhì)激素的提取效果較佳，加 標(biāo)回收率 在80%120%之間，采用其他兩種提取劑時(shí)，個(gè)別糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率低 于75%o綜上，對(duì)于精油樣品，采用正己烷分散后，70%乙膳水溶液提取的

9、方式進(jìn)行前處理。1.2其他類化妝品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化化妝品成分復(fù)雜多樣，采用LC-MS/MS法測(cè)定時(shí)可能因基質(zhì)效應(yīng)影響分析準(zhǔn)確性，因此可以通 過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件以盡可能去除基質(zhì)干擾。本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)樣品加標(biāo)試驗(yàn)對(duì)比了三種前處理方法（甲醇 直接提取法，飽和食鹽水分散、乙膳提取法，HLB固相萃取小柱凈化法）對(duì)4類典型化妝品（水劑、乳液、膏霜、洗面奶）中11種糖皮質(zhì)激素的提取效果。具體加標(biāo)試驗(yàn)前處理方法如下：甲醇直接提取法：稱取0.5g樣品于10 mL比色管中（制備平行樣品）,加入標(biāo)準(zhǔn) 溶液至加 標(biāo)濃度為0.2卩g/g混勻。加入少許甲醇，渦旋混勻，然后用甲醇定容至10 mL,渦旋30 s,超聲提取 20 mi

10、n,渦旋1 min。必要時(shí)離心，取上清液經(jīng)0.22 yn有機(jī)濾膜過(guò) 濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。飽和食鹽水分散、乙月青提取法：稱取0.5g樣品于10mL比色管中（制備平行樣品）,加入 標(biāo)準(zhǔn)溶液至加標(biāo)濃度為0.2卩g/g混勻。加入1 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30s,然后加入乙膳并定 容至10 mL,渦旋30s,超聲提取20 min,渦旋1 min,必要時(shí)離心，取上清液經(jīng)0.22卩有機(jī)濾膜 過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。HLB固相萃取小柱凈化法：稱取0.2g樣品于10 mL塑料離心管中（制備平行樣品）,加入 標(biāo)準(zhǔn)溶液至加標(biāo)濃度為0.2卩g/g混勻。按照GB/T 2480022009中前處理方法進(jìn)行 提取和HLB固

11、 相萃取小柱凈化（具體處理過(guò)程為：加入3mL飽和氯化鈉溶液分散，然 后加入2mL乙膳，充分渦 旋提取2 min,離心；吸出上層清液于50 mL塑料離心管中，下層氯化鈉溶液用2 mL乙膳重復(fù)提取 一次，合并上清液；然后往提取液中加入40 mL高純水，混勻，加入0,2mL亞鐵氧化鉀溶液， 混勻，加入0,2mL乙酸鋅溶液，混勻，離心；上清液進(jìn)行HLB固相萃取小柱凈化,10%乙月青水 溶液淋洗，用4 mL甲醇洗脫至10mL比色管中，甲醇定容至5mL,取適量試液經(jīng)0.22 yn有機(jī)濾膜 過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于水劑、乳液、膏霜、洗面奶化妝品，采用以上三種方法進(jìn)行前 處理，以溶 劑校準(zhǔn)曲線

12、法定量時(shí)，大部分樣品都存在明顯的基質(zhì)抑制，導(dǎo)致多個(gè)糖皮質(zhì) 激素的回收率低于 70%o方法采用了 HLB柱進(jìn)行凈化，可改善其中少部分糖皮質(zhì)激素的基質(zhì)抑制情況，但仍有多種 糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率低于70% （特別是對(duì)于洗面奶產(chǎn)品）,不能達(dá)到分析方法要求。基于上述試驗(yàn)結(jié)果，因此本研究擬從以下兩方面對(duì)樣品前處理進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化：a）對(duì)于水劑、乳液、膏霜類樣品，擬采用溶劑直接提取法，以基質(zhì)校準(zhǔn)曲線定量，下一步將 優(yōu)化提取溶劑類型；b）對(duì)于洗面奶類樣品，擬繼續(xù)優(yōu)化固相萃取凈化方法，以進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng)。1.2.1水劑、乳液、膏霜類化妝品提取劑的選擇相對(duì)于水劑和乳液樣品，膏霜樣品成分更為復(fù)雜，因此選取膏霜類樣

13、品作為代表性 樣品，對(duì)比 研究了 8種不同提取劑（甲醇、80%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、20%甲醇 水溶液、乙月青、 80%乙月青水溶液、50%乙膳水溶液、20%乙膳水溶液）對(duì)11種糖皮質(zhì)激 素的提取效果。具體試驗(yàn)方法為：稱取0.5g樣品于10mL比色管中（制備平行樣品）,加入標(biāo)準(zhǔn)溶液至加標(biāo) 濃度為0.2卩g/g混勻。加入少許提取劑，渦旋混勻，用提取劑定容至10mL,渦旋30 s,超聲提取20 min,渦旋1 min。必要時(shí)離心，取上清液經(jīng)0.22 yn有機(jī)濾膜過(guò) 濾至進(jìn)樣小 瓶,待LC-MS/MS測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用20%甲醇水溶液和20%乙膳水溶液作為提取劑，膏霜樣品中部分糖皮質(zhì)激

14、 素提取效果較差，采用其余6種提取劑對(duì)所有目標(biāo)物均能得到良好提取效果，且加標(biāo)回收率相差不大 （以基質(zhì)校準(zhǔn)曲線定量），考慮到乙月青提取液中雜質(zhì)較少，且較 容易過(guò)濾，因此選取乙膳作為水劑、乳 液、膏霜類化妝品的提取劑。1.2.2離子交換固相萃取柱對(duì)洗面奶樣品的凈化效果洗面奶樣品中含有較高含量的表面活性劑，在進(jìn)行LC-MS/MS分析時(shí)可能產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)， 影響分析準(zhǔn)確性。表面活性劑按照極性基團(tuán)的解離性質(zhì)可分為陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活 性劑、兩性離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑四類。5表1 WAX、MAX、WCX小柱對(duì)洗面奶中11種糖皮質(zhì)激素的回收率結(jié)果化合物回收率（） *WAXMA

15、XWCX甲醇提取16a輕基潑尼松龍7971727916 a輕基潑尼松龍醋酸酯：34425546二氟拉松90818195地索奈德40403843氟輕松80777781去輕米松87798390帕拉米松醋酸酯52556662地索奈德醋酸酯5042雜質(zhì)干擾導(dǎo)致無(wú)法定量雜質(zhì)干擾導(dǎo)致無(wú)法定量甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯40445048鹵倍他索丙酸酯31292828倍他米松丁酸丙酸酯38373738注* :進(jìn)行回收率測(cè)試的樣品為品牌1洗面奶。100A03%10430.80 0.863.00 3 27 / 3.633.00rooc100%-10.310:F"3.0D .兀6DPj10、100 1D9.96

16、 10.4209.0010.00q nnE018.009.0010.001.002.003.00006.007.00TPZ200116-4516MET02-neg200116-STD_500B03-neg100700、2.00 - 3.00 .2001164516MAXJB102n eg0.1 r 00.i .2.0010W11.2814.22roo12.0013.0014.001:T0F MS ES-TIC1.28e5100B%.0.843.00 3.29 30： ' - 2001164516WCXJB102neg8.3 8QUe11.2514.1911.289.0011.0011.

17、2811.0011 41.r m 02 imi44 W.09'-4擴(kuò)圖1 Q-TOF負(fù)離子模式全掃描總離子流色譜圖11.0012.0013.0014.0014.2212.0012.0012 07 12.23 1235 2 8112.0013.0013.0013.0015.00 r 16.001: TOF MS ES- TIC 1.23e515.0014.9914.00-f "15.0014.2614.0015.0014.9913.5114.0016.001：T0F MS ES-TIC9.16e416.001:TOF MS ES-TIC1.10e516.001: TOF MS

18、ES- TIC 6.57e314.4415.00Time 16.00（A:甲醇提?。籅 : WCX小柱凈化；C： MAX小柱凈化；D: WAX小柱凈化；E: 11種糖皮 質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.5 mg/L）進(jìn)一步采用超高效液相色譜四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLCQTOF）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品試液進(jìn)行負(fù)離子模式全掃描分析，結(jié)果如圖 1所示。由圖可看出，WCX凈化試 液的TIC圖與甲醇提取試液的基本一致，說(shuō)明采用WCX凈化的效果不明顯；WAX、MAX凈化試液的 TIC圖中，某些雜質(zhì)峰的響應(yīng)值明顯較甲醇提取試液中相應(yīng)峰的響應(yīng)低，且MAX凈化試液中更明 顯，說(shuō)明采用WAX、MAX凈化可降低部分基質(zhì)干

19、擾，且MAX的凈化效果優(yōu)于WAX。1.2.3不同上樣量對(duì)洗面奶凈化效果的影響根據(jù)上述研究結(jié)果，MAX柱雖然能降低部分基質(zhì)干擾的質(zhì)譜響應(yīng)，但未能明顯改善 基質(zhì)抑制。 推測(cè)可能是因?yàn)闃悠分斜砻婊钚詣┖枯^高，樣液上樣量過(guò)大，超出固相萃 取小柱的柱容量，導(dǎo)致基 質(zhì)效應(yīng)不能有效去除。因此，進(jìn)一步對(duì)比研究了降低上樣量（0.5mL、1 mL,具體試驗(yàn)方法同 1.2.2,最后分別用與上樣量等體積甲醇復(fù)溶）的凈化效果。結(jié)果顯示（見(jiàn)表2）,減少上樣量未能有 效改善基質(zhì)效應(yīng)，多個(gè)糖皮質(zhì)激素的回收率低于70%o表2 MAX小柱不同上樣量對(duì)洗面奶中11種糖皮質(zhì)激素的回收率結(jié)果化合物回收率（） *0.5 mL1 mL甲

20、醇提取16a輕基潑尼松龍72737816a輕基潑尼松龍醋酸酯424048二氟拉松919599地索奈德564748氟輕松808084去輕米松888994帕拉米松醋酸酯丁626267地索奈德醋酸酯5659雜質(zhì)干擾導(dǎo)致無(wú)法定量甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯484850鹵倍他索丙酸酯343234倍他米松丁酸丙酸酯353138注* :進(jìn)行回收率測(cè)試的樣品為品牌1洗面奶。進(jìn)一步采用UPLC-Q-TOF法對(duì)不同上樣量的樣品試液進(jìn)行正離子模式全掃描分析，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見(jiàn)，隨著上樣量降低至0.5mL時(shí)，雖然部分雜質(zhì)響應(yīng)明顯降低，但仍然很高，且與目標(biāo)物共流出，抑制目標(biāo)物的響應(yīng)，不能達(dá)到滿意的基質(zhì)效應(yīng)去 除效果。

21、200205-4516-MET1004.89 5.021:TOF MS ES+TIC5.62e50.58 &.802.323.865.71624 6577558.05 8.118.999.6011.52 11.98 12.54 13.021.00200205-4516-MAX 2 100%0.57 0.81200205-4516-MET1.00208885-4516-MAX 1-51000.58 °.800.57 0.80200205-4516-MAXA200005-4516-MAX 11000.57 0.810.57 0.812002B5208385 4516-MAX 0

22、51000.57(0 &0.571.00200205-3亠200205-TPZ 11S 1P01100% 0.57 0b2.003.Q02.332.003.002.322.332 003.00*2.003.00B2332.363.002.o(r 頷c2.332.352.003.Q02.003.004.005.006.007.00&009.004 . 915.068.055.386.298.993.895.717.294.005.006.007.00&009.004.89 5.024.96 5.088.05 8.11&247.55 7.98 8.098.993.8

23、65.4 刃 6.29.003.89.264.005.005.7H6 007.00&009.004.005.006.007.00&009.004 . 915.064.96 5.78.053.894.835.385.44625.716.28298.00 .098.993.914.005.00-k7.00 -&009.039.004.00590° SOP.®4廠'7.00&009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.009.6811.5112.3410.0011.0012.0013.0014.0015.009.60

24、-.52 11.9812.54 伯亦9.71 =-11.5012.98-188011.0012.0013:14.0015.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00S.6811.5112.346310-8111.4713.0010.0011.00I2.ooty.rl3.oo14.0015.0010.00*11.0012.0013.0014.0015.0016.0017.001：TOF MS ES+TIC5.05e516.00用昨.矽763M17.0016.00'：T°F msos1T0FMSESTC4.02e516.0017.001600WA%1.002

25、OO2°5-lai6-MAX. 8 51.00 1000.812.003.00霽'站/ 片 iv/.Mir：2.003.005.144.995.207.98 8.095.426.28.059.003.893.93如叫"7.267294.005.006%&7.00&009.004.00 a5 亡 086.007.00&009.00X GA °78.00 8.094.835446.283.915.717.349.034.005.006.007.00&009.00匸/a|T. 9.004.005.00.46.007.008.004

26、.995.209.7111.5012.989.5111.8214.4310.0011.00.13.00!4g15.0010.00*11.0012.0013.0014.0015.0011 4711.74 1 aa九°°11 8812.36"Xi r1445 146010 68m 12.88aw108111 47Art10.0011.0012.0013.0014.0Q15.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00力口1： top MS 馬 eg2.45e516.0017.00伽円詩(shī)漲冷c1： TOF MS16.0017.001：T0F MS E

27、Sme16.0017.00 TIC2.45e50.572.35體積；八爲(wèi)黑熬您嚴(yán)乂;100 濃度為 1.0 mg/L）圖2 Q卻OB正離子模武全掃描總離子流色譜圖393.773.o（D : l .o（HlL 丄懺7.2911.8214.43G0.5mL上樣體積。;11.4711.00W.6811種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)溶溶液収17.001:T0F MS ES+ TIC 7.34e49.68 103211 74 11.8812.361 4 29 1445 146012.881.2.4柱容量對(duì)洗面奶凈化效果的影響8.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00Time

28、17.00根據(jù)上述研究結(jié)果，降低上樣量可有效降低雜質(zhì)響應(yīng)?？紤]到所使用的MAX柱的柱容量較小（0.25 meq/g）,因此進(jìn)一步考察了柱容量較高的強(qiáng)陰離子交換固相萃取小柱SAX（phenomenon, 500 mg/3 cc,柱容量0.78 meq/g）對(duì)洗面奶樣品中的雜質(zhì)干擾去除效果，同時(shí)也考 察了不同上樣量（0.2 mL、0.5 mLv 1 mL、2 mL）的影響。具體試驗(yàn)方法為：稱取0.2g樣品（制備平行樣品）,甲醇定容至5mL,加入標(biāo)準(zhǔn)溶 液至加標(biāo)濃 度為2.5卩g/g超聲提取20 min,離心，取約1 mL溶液過(guò)0.22 yn有機(jī)濾膜至進(jìn)樣小瓶，得甲醇提取 試液。另外分別取上清液0.

29、2mL、0.5 mLv 1 mL、2mL上樣至已活化好的SAX小柱，接流出液，用甲醇洗脫至5 mL, 15 0.22卩有機(jī)濾膜至進(jìn)樣小瓶，得SAX凈化試液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品試液進(jìn)行LCMS/MS分析，結(jié)果顯示（見(jiàn)表3） , SAX柱凈化試 液中16。 輕基潑尼松龍等幾種糖皮質(zhì)激素的回收率與甲醇提取試液中相比得到顯著改 善；當(dāng)上樣量為0.2 mL 時(shí)，凈化試液中門種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率范圍在81%114%之間，隨著上樣量的增加，部分糖 皮質(zhì)激素（16亠輕基潑尼松龍和鹵倍他索丙酸酯）的加標(biāo)回收率呈降低趨勢(shì)?？紤]到采用0.2mL上 10樣量?jī)艋蟮脑囈号c甲醇提取試液相比，實(shí)際是稀釋了藥倍'

30、因此將甲醇提取試液稀釋倍后進(jìn) 行測(cè)試并作對(duì)比。結(jié)果顯示（見(jiàn)#表3）,除倍他米松丁酸丙酸酯的回收率較低外，其余糖皮質(zhì)激素的回收率均與凈化試液中的結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別。因此，本實(shí)驗(yàn)無(wú)法證明采用SAX凈化能有效去除所有糖皮質(zhì)激素的基質(zhì)效應(yīng)表3 SAX小柱對(duì)洗面奶中11種糖皮質(zhì)激素的回收率結(jié)果化合物回收率（）*0.2 mL0.5 mL1 mL2 mL甲醇提取甲醇提取稀釋25倍16 a輕基潑尼松龍81847471628816a輕基潑尼松龍醋酸酯114101101105110118二氟拉松101104102103108105地索奈德938886869588氟輕松105106951028599去輕米松101110

31、1011074499帕拉米松醋酸酯10910999107103110地索奈德醋酸酯108105105934296甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯10398979958100鹵倍他索丙酸酯999280772794倍他米松丁酸丙酸酯107108105947063注* :進(jìn)行回收率測(cè)試的樣品為品牌2洗面奶。進(jìn)一步采用UPLCQTOF法對(duì)樣品試液進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式全掃描分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可看出，在負(fù)離子模式下，采用SAX柱凈化可明顯降低基質(zhì)干擾的質(zhì)譜響 應(yīng)。但在正離子模式下，采用SAX柱凈化不能明顯降低基質(zhì)干擾的質(zhì)譜響應(yīng)。這 可能是因?yàn)?SAX柱凈化只能去除樣品中的陰離子表面活性劑。綜上，采用SA

32、X柱凈化不能達(dá)到滿意的基質(zhì)效應(yīng)去除效果。1TPZ200211-4120081005 951:T0FMS ES+TIC3.62e50J0$6 1 112D94eo647 6 66h.f1.833.514 255 107.9T.Wi Wr V7 3610311Z63133711 31430 媲oooeo200219-XMN-8 1mL SAX-1 4005.B65®510 1ftPCS1957.970Trr5 86Dio.noQ9313 4510001 GG200219-XMN-8 0-2mL SAX-1 8Be.47 ec 10.80062 -11rr?W203249 XMN 8 Q.

33、5mL SAX-1 20B%0622 £62030J6mi納Jb kS1 TPZ2C02I0-XKTJ-8 MET 7OTB »4EG5.M16.0X)齊.0)01:T0FMS ESTIC3.45e513 3114.977 99rB16P041:T0FMS ES> TIC 2.13©512.9013206.4714.9815.tif16P077301.TOF MS ES*TIC1 29e5M3813 001200140012.511201 125013.2513 W1:TOFMS ES個(gè) TIC 1.27©5294TOTE5.86：血.20 14.

34、95心g1：TOP VISES-"3591ICO “oao1823W4QD5 00TOO8 007S86700.637 2223I £88002CC21&XMN 8 imlSX 1 4QQ NEC7 497.667 22foo2tXXM4XMN4 2ml SAX-1 SOS NEG4 234 45«oa837B«5nas，208 "1274 Z *14.349QdiodbnOo17tOB OOi4 e1503o.eoB.&SBfiOuoo2 5713 76m.29141S.6o170)1：TOFktS£S-TC1 03

35、e511»10 822計(jì)7 XTIC4 65e5ICO -<17ae1370.厶11.S5、13J°"1471«%:0.035 70"SsurotO.fld 11)03U78P、<<<0-11 S7.2 95326用 6.304.437.24> * -»17G01：10f K«5ES-«*F WJ1：TOMSESTIC6機(jī)4268%-4.00300200219-XMW-S 0-5mL SAX-1 206 NEG1001.00 2.00沏219刪曲!% 沁単應(yīng)仏

36、GTIC7.52643 006X»7.00800fi.ao1O1001:脅0.831(0*-r2.003JX)4.Q06«007.008.0014.&1I陽(yáng)0.001：T0FMSES- TIC 8.4464A Y訛7-oo3 Q-TOF正負(fù)離子模式全掃描總離子流色譜圖(A:甲醇提取(+ ) B： 2mL± 樣(+) ； C: 1 m 樣(+)0.5 mL ± 樣(+)0.2 mL 上樣(+) ； F:甲醇提取(-);G： 2mL上樣(-); H： 1 mL ±樣(-);1: 0.5 mL 上樣();J: 0.2mL上樣(-)WCX、WA

37、X、MAX、1.2.5 Captiva EMR-Lipid小柱對(duì)洗面奶的凈化效果根據(jù)上述研究結(jié)果，針對(duì)表面活性劑極性基團(tuán)的特性，采用SAX等陰、陽(yáng)離子交換固相萃取柱均不能有效去除洗面奶樣品中的表面活性劑基質(zhì)干擾。 究其可能原因，主要有兩方一是目前洗面奶產(chǎn)品中使用的表面活性劑不限于陰離子 表面活性劑。通過(guò)UPLC-QTOF全掃描分析發(fā)現(xiàn)，與目標(biāo)物共流出的表面活性劑也包括 兩性離 子型表面活性劑、非離子型表面活性劑等，這些表面活性劑很難被上述固相萃取 柱全部去除；二 是產(chǎn)品中表面活性劑的含量較高，固相萃取柱的柱容量較小，不足以去 除表面活性劑帶來(lái)的基質(zhì) 效應(yīng)。鑒于以上原因，以下將針對(duì)表面活性劑中的

38、非極性基團(tuán)進(jìn)行研究，繼續(xù)探尋基質(zhì)效應(yīng)去除 方法。目前洗面奶產(chǎn)品中可能使用的表面活性劑主要為陰離子型（如棕梱酸、月桂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸等及其鹽）、非離子型（如椰油酰胺MEA、月桂酰胺DEA、甘油 硬脂酸 酯等）、兩性離子型（如椰油酰胺丙基甜菜堿、月桂基短基磺基甜菜堿、月桂酰 兩性基乙酸鈉 等），而這些表面活性劑中一般都含有長(zhǎng)的直碳鏈結(jié)構(gòu)。某些基于體積排 阻和特殊填料化學(xué)特性 的固相萃取柱可能對(duì)于該特定結(jié)構(gòu)具有良好的去除效果。體積排 阻表現(xiàn)為無(wú)分支的碳鏈很容易進(jìn) 入填料的孔隙，得以保留在填料中，而糖皮質(zhì)激素的空間位阻較大，難于進(jìn)入填料空隙，不被保 留。填料的特殊化學(xué)特性體現(xiàn)為長(zhǎng)直碳鏈進(jìn)入孔

39、隙后和填料間產(chǎn)生疏水相互作用進(jìn)而被吸附，增 強(qiáng)保留能力。Captiva E MRLipid（Agile nt, 600 mg/5 cc）柱兼具兩種特性，因此，考察了其對(duì)洗面奶的凈化效果，并采用分步 加樣的方式考察其柱子的吸附容量。具體的試驗(yàn)方法為：稱取0.2g樣品（制備平行樣品）,加入標(biāo)準(zhǔn)溶液至加標(biāo)濃度為25卩 g/g渦旋混勻。用80%乙月青水溶液定容至5mL,超聲提取20 min,離心，取上清液直接加 入Captiva EMR-Lipid小柱中（無(wú)需活化，直接上樣），待樣液全部滲入吸附劑中后，用洗耳 球緩慢將柱中樣液完全吹出至帶有內(nèi)襯管的進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。接著分四次向柱中加入0.5 mL樣

40、液，重復(fù)上述操作，每次分別接收全部的流出液，待測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品試液采用LC-MS/MS進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（見(jiàn)表4）,當(dāng)上樣量為1 mL 時(shí)，大部分糖皮質(zhì)激素的回收率相對(duì)較高，其中除16輕基潑尼松龍和倍他米松丁酸丙酸酯外（回收率不足70%）,其他9種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率在86%117%之間；繼續(xù)增加上樣量 至1.5mL,去輕米松、地索奈德醋酸酯、鹵倍他索丙酸酯三種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率顯著 下降，均降至不足60%;繼續(xù)增加上樣量至2mL,甲基潑尼 松龍醋酸丙酸酯的回收率顯著下降至 不足50%o表4 Captiva EMR丄ipid小柱（不同上樣體積）對(duì)洗面奶中11種糖皮質(zhì)激素的回收率結(jié)果化

41、合物回收率（）*1 mL1.5 mL2mL2.5 mL3 mL80%乙月青水直接提取16a輕基潑尼松龍54606355676216a輕基潑尼松龍醋酸酯10997110116112114二氟拉松102106115104114111地索奈德9211311710392102氟輕松11798115948074去輕米松1094744424137帕拉米松醋酸酯1071091189710296地索奈德21 醋酸酯1005250474634甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯868638464849鹵倍他索丙酸酯864545504725倍他米松丁酸丙酸酯686768707049叫0A螢B2D2?l7 XUMfl 2Tt L

42、PD1 T'-D'» JaMMNPVWUpp,TPZwtFCLL.TPZKQvrvmAr1ES3I821 1?low r»20>Y25610 i XTTJ»jr9312 W't>WffucI* H嚮曾T.CO：TG5023谿“|5W53站1 TOFMSE&B74Y2j5210.2810 劇HM8注* :進(jìn)行回收率測(cè)試的樣品為品牌2洗面奶。1；E：J: 11 mL上樣mL上樣（A : 3 mL 上樣（+） ; B： 25 mL 上樣（+） ； C： 2 mL 上樣（+） ； D: 1.5mL 上樣（+）（+） ； F： 3

43、 mL 上樣（-）;G：2.5 mL 上樣（）;H : 2 mL 上樣（-）;1: 1.5 mL 上樣（）； （-） 進(jìn)一步采用UPLC-Q-TOF法對(duì)樣品試液進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式全掃描分析，結(jié)果見(jiàn) 圖4。從圖中可看出，在樣液上樣體積為1 mL時(shí)，凈化效果最佳，這也與LC-MS/MS測(cè)得回收率 結(jié)果一致。隨著上樣體積的增加，超出柱子的最大吸附容量，更多雜質(zhì)被洗出?；谏鲜龌厥章式Y(jié)果及Q-TOF全掃描分析結(jié)果，選取1 mL樣液作為上樣體積，直接過(guò) Captiva EMR-Lipid小柱，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)凈化條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)比研究了90%乙膳水溶液、80%乙膳水溶液、70%乙膳水溶液、60%

44、乙膳水溶液四種不同提取劑提取，通 過(guò) Captiva EMR-Lipid小柱凈化后的基質(zhì)去除效果，并與不經(jīng)凈化的提取效果進(jìn)行對(duì)比。具體試驗(yàn)方法為：稱取0.2g樣品（制備平行樣品）,加入標(biāo)準(zhǔn)溶液至加標(biāo)濃度為25卩g/g 分別用不同提取劑定容至5mL,超聲提取20 min;離心，取上清液約1 mL ,過(guò)0.22 ym有機(jī)濾膜 至進(jìn)樣小瓶，得樣品未凈化試液；另取上清液1 mL直接加入CaptivaEMR-Lipid小柱中（無(wú)需活化，直接上樣）,待樣液全部滲入吸附劑中后，用洗耳球緩慢 將柱中 樣液完全吹出至帶有內(nèi)襯管的進(jìn)樣小瓶中，得樣品凈化試液，待測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)表5）,當(dāng)提取劑中乙月青比例為90

45、%和80%時(shí)，樣品凈化試液中除16。輕 基潑尼松龍外，其他糖皮質(zhì)激素過(guò)柱后回收率均較未凈化試液明顯提高，在80%以上；當(dāng)提取劑中乙膳比例為70%和60%時(shí)，過(guò)柱后一些糖皮質(zhì)激素回收率相較不過(guò)柱 沒(méi)有明 顯改善，甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯和倍他米松丁酸丙酸酯的回收率甚至更低。四種提取溶劑凈化 試液中16輕基潑尼松龍的回收率均低于70%,可能是因?yàn)樵撐镔|(zhì)與小柱填料存在一定的吸附 作用造成的。表5不同提取劑（Captiva EMR丄ipid小柱）對(duì)洗面奶中11種糖皮質(zhì)激素的回收率結(jié)果化合物回收率（）*90%乙膳水80%乙月青水70%乙膳水60%乙月青水凈化不凈化凈化不凈化凈化不凈化凈化不凈化16a輕基潑

46、尼松龍458751687076657516a輕基潑尼松龍醋酸酯95108106107110113116106二氟拉松98108110107116107114111地索奈德8392869692676368氟輕松1148412280114409346去輕米松9843994353443145帕拉米松醋酸酯11211312210712310785104地索奈德醋酸酯9640983535151013甲基潑尼松龍醋酸丙酸酯9251925761551456鹵倍他索丙酸酯10219872047101311倍他米松丁酸丙酸酯785572572754258注* :進(jìn)行回收率測(cè)試的樣品為品牌2洗面奶。TPZKTOF

47、MSES-TIC3.70e620022 工 XMk-8 6OACN imL UPOI.qo532A.P 、廣20CG2SW1 ： TOF MSES-636TIC32365 8S 8"9 B2716.00 17 00o '1 1.DBZD#20022 * XMN0 &0AGU 皿 LIRM>)100385“. 14.499 221220嗆汕茫即 山6 78 666C C也毎早63I f 啊 14,0 Z小聲.；M.76.宀；八V腫“QMSESTIC9.51645 270 0313.8914.71H.OOrwj12.0013.001400W ” M 00'

48、wsT2.99 諒歸2012 雀況.“y77r)oKTOFMSES-TIC9.«7e41005 2 114110.52!4.dSTime紋03TPZ2oo即加a訛20022*XMN8?aAe*|KTOFMSES-TIC6.6 !6516*01： TOf MS ES-QQToT 200224!vtrTIC627e516.0017001：TOFMSES-20a22*XMN89aA1X>100zw2必W8.dfa 邨TIC5-iaeS't>5«UM 、s-i: 11&23W4WH罟J" SmiL-113u.66G66133圖5 Q-TOF負(fù)離

49、子模式全掃描總離子流色譜圖1700L TOF MS ESTIC4 2365.TrnQ(A : 60%乙臘水+過(guò)柱；B: 70%乙膳水+過(guò)柱；C: 80%乙膳水+過(guò)柱；D: 90%乙膳水+過(guò)柱；E: 60% 乙月青水+不過(guò)柱；F: 70%乙月青水+不過(guò)柱；G : 80%乙月青水+不過(guò)柱；H : 90%乙膳水+不過(guò)柱)進(jìn)一步采用UPLC-Q-TOF法對(duì)樣品試液進(jìn)行負(fù)離子模式全掃描分析，結(jié)果見(jiàn)圖 5o 從圖中可以看出，隨著提取劑中乙月青比例的減少，雜峰的響應(yīng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)，可能的原因有兩個(gè)：- 是由于洗面奶中表面活性劑極性較強(qiáng)，隨著提取液中水相比例增大，被提取的表面活性劑含量越 高；二是提取試液在經(jīng)過(guò)Captiva EMR-Lipid小柱時(shí)，在試液所帶溶 劑與小柱吸附劑之間的吸附與 解吸附過(guò)程中，隨著試液所帶溶劑水相比例增大，表面活性劑等雜質(zhì)在小柱上的吸附量減少，大部 分隨試液所帶溶劑流出，從而造成凈化效果相對(duì)較差。另外，隨著提取液中水相比例增大至 30%,凈化后