實(shí)驗(yàn)9氣相色譜、內(nèi)標(biāo)法測定蘑菇醇的含量(20210111041142)

1、內(nèi)標(biāo)法測定蘑菇醇的含量【摘要】氣相色譜法（GC分離效率、選擇性、靈敏度都很高，適用于熱穩(wěn)定性好、易揮發(fā)的物質(zhì)。外標(biāo)法通 過配置標(biāo)準(zhǔn)溶液來制作工作曲線，但使用溶液體積很少時(shí)誤差較大，可以通過加入內(nèi)標(biāo)物減小誤差。本實(shí) 驗(yàn)通過內(nèi)標(biāo)法和氣相色譜法來測定未知物中的蘑菇醇含量?！娟P(guān)鍵字】 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法蘑菇醇【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、了解氣相色譜法的基本原理及儀器結(jié)構(gòu)。2、了解氣相色譜基本儀器操作。3、掌握內(nèi)標(biāo)法的配樣與計(jì)算方法。【基本原理】-原理概述：氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS ）近年來在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域起到越來越重要的作用，其原理是利用氣相色譜的分離能力，將樣品各組分分離開，然后對(duì)各組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，得出組分信息。再利

2、用 內(nèi)標(biāo)法制作工作曲線來計(jì)算未知物濃度。?氣相色譜法（GC :是利用氣體作流動(dòng)相的色層分離分析方法。優(yōu)點(diǎn)：分離效率、選擇性、靈敏度都很高。缺點(diǎn)：只適用于熱穩(wěn)定性好、易揮發(fā)的物質(zhì)。?內(nèi)標(biāo)法：在分析測定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)物的選擇要求：1、是能得到純樣的己知化合物;2、和被分析的樣品組分有基本相同的物理化學(xué)性質(zhì)(化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物;3、不與樣品中各組分充分分離發(fā)生反應(yīng);4、既可被色譜柱所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾,原理

3、：只要測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量:Xi =m/ 人沢仁100%m：樣品的質(zhì)量;ms：待測樣品中加入內(nèi)標(biāo)物的量;As:待測樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積;fs,i:組分i與內(nèi)標(biāo)物的校正因子之比，稱為相對(duì)校正因子。蘑菇醇：即1-辛烯-3-醇分子式：GHiQ;分子量：128.21應(yīng)用：用于日化和食用香精；作為化學(xué)合成原料,應(yīng)用於制藥領(lǐng)域；作為蚊蟲引誘劑，應(yīng)用于殺蚊制品。圖1蘑菇醇結(jié)構(gòu)式【儀器與試劑】1、儀器：Agilent7890N 氣相色譜儀，10卩進(jìn)樣針，1000 移液槍。2、試劑：蘑菇醇儲(chǔ)備樣(10.107mg/ml )，內(nèi)標(biāo)物(10.140mg/ml

4、)，蘑菇醇未知樣，乙腈溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1、配制標(biāo)準(zhǔn)溶液:以移液槍分別移取200、400、600、800、1000 蘑菇醇儲(chǔ)備液和 400、400、400、400、400卩氯苯儲(chǔ)備液與5ml容量瓶中，用乙腈定容到刻度。2、配制未知溶液:以移液槍量取200卩蘑菇醇未知液和 400卩氯苯儲(chǔ)備液與5ml容量瓶中，用乙腈定容到刻度。3、設(shè)定氣相色譜參數(shù)：進(jìn)樣口：氣化溫度:250C，分流比：10:1 ;色譜柱：流速:2.0ml/min ;柱溫箱：120 C（保持 1min）, 10 C /min 升到 200 C；檢測器：基座溫度 250C, H2： 45ml/min , Air : 450ml/min

5、 , Nk： 40ml/min。保存。4、進(jìn)樣：以以上方法測定標(biāo)樣及未知樣，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（保留時(shí)間及峰面積）。5、做出內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算未知樣中蘑菇醇含量?！咀⒁馐马?xiàng)】1、配制溶液時(shí)要注意不要將溶液滴到容量瓶外面，否則會(huì)大大影響測量的結(jié)果；移液槍的使用要規(guī)范，每種溶液用各自的槍頭。2、GC中手動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)的熟練與否，直接影響到分析結(jié)果的好壞，正確的進(jìn)樣手法是：取樣后，一手持注射器（防止氣化室的高氣壓將針芯吹出 ），另一只手保護(hù)針尖（防止插入隔墊時(shí)彎曲）。先小心地將注射針頭穿過隔墊，隨即快速將注射器插到底，并將樣品輕輕注入氣化室（注意不要用力過猛使針芯彎曲），同時(shí)按start鍵，拔出注射器

6、，注射樣品所用時(shí)間及注射器在氣化室中停留的時(shí)間越短越好。2、在進(jìn)多個(gè)不同樣品時(shí)，每次進(jìn)樣前都要將進(jìn)樣針潤洗干凈，確保洗針溶劑不干擾樣品檢測。在測定標(biāo)樣以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，由于進(jìn)樣的濃度是梯度升高的，在測定前只用每次的待測液潤洗即可。若先進(jìn)高濃度溶液樣品再進(jìn)低濃度溶液樣品則還得用溶液（乙腈）洗凈?！緮?shù)據(jù)處理與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1、試劑濃度與測量數(shù)據(jù)：蘑菇醇儲(chǔ)備樣10.107mg/ml ;內(nèi)標(biāo)物10.140mg/ml。t內(nèi)標(biāo)（min）t蘑菇醇（min）A蘑菇醇A內(nèi)標(biāo)A蘑菇醇/A內(nèi)標(biāo)c蘑菇醇/c內(nèi)標(biāo)標(biāo)樣11.72.2546.81105.60.49460.4984標(biāo)樣21.82.21093.31012.11

7、.08020.9967標(biāo)樣31.82.21498.89681.54831.4951標(biāo)樣41.82.22235.31082.92.06421.9935標(biāo)樣51.82.22738.41053.42.59962.4919未知物1.82.2665.510390.6405表1標(biāo)樣與未知物保留時(shí)間與峰面積數(shù)據(jù)2、內(nèi)標(biāo)法：由Xi =ms X A X fs,i 共0100%可知，以c蘑菇醇/c內(nèi)標(biāo)橫坐標(biāo)，為A蘑菇醇/A內(nèi)標(biāo)縱坐標(biāo)作 mx As內(nèi)標(biāo)法曲線，曲線擬合如下：內(nèi)標(biāo)工作曲線2.5 -2.0 -標(biāo)內(nèi)醇菇蘑1.5 -1.0 -0.5 -Equati ony = a + b*xPlotA蘑菇醇/A內(nèi)標(biāo)In t

8、erce pt0.00221 ?0.02967Slo pe0.9586 ?0.01723Residual Sum of Squares0.00241P ears on's r0.99952R-Square(COD)0.999030.51.01.52.02.53.0由圖可得，擬合的直線為C蘑菇醇/C內(nèi)標(biāo)圖2內(nèi)標(biāo)法工作曲線y = 0.9586X + 0.00221，R = 0.99952。由測定數(shù)據(jù)計(jì)算得，未知樣的峰面積之比為0.6405，代入上述擬合直線進(jìn)行計(jì)算得x = 0.6659，即c蘑菇醇/c內(nèi)標(biāo)=0.6659?？捎?jì)算得未知樣蘑菇醇的濃度為:c未知樣=0.6659 沢 10.140

9、mg/mZ= 13.504mg/ml200卩 l3、外標(biāo)法：以C蘑菇醇/C內(nèi)標(biāo)橫坐標(biāo)，為A蘑菇醇縱坐標(biāo)作外標(biāo)法曲線，曲線擬合如下:30002500200015001000外標(biāo)工作曲線一 Lin ear Fit of Sheet1 B"A 蘑菇醇“zJ-Equati ony = a + b*xP lotA蘑菇醇In terce pt-32.9604 ?89.65199Slo pe1062.99066 ?52.06075Residual Sum of Squares21956.64563P ears on's r0.99642R-Square(COD)0.992860.51.01

10、.52.0c蘑菇醇/c內(nèi)標(biāo)圖3外標(biāo)法工作曲線2.53.0Lin ear Fit of Sheet1 B"A 蘑菇醇 /A 內(nèi)標(biāo)”500由圖可得，擬合的直線為 y = 1062.99066X - 32.9604，R = 0.99642。由測量數(shù)據(jù)得：A蘑菇醇=665.5，帶入上述擬合曲線進(jìn)行計(jì)算得x = 0.6571，即c蘑菇醇/C內(nèi)標(biāo)=0.6571?？捎?jì)算得未知樣蘑菇醇的濃度為:C 未知樣=0.6571 沢 10.140mg/m|x00 = 13.326mg/ml200卩 1由擬合曲線的數(shù)據(jù)可以看出：外標(biāo)法的相關(guān)系數(shù)比內(nèi)標(biāo)法的相關(guān)系數(shù)小，說明內(nèi)標(biāo)法確實(shí)優(yōu)于外標(biāo)法?！舅伎碱}】1、你做出

11、來的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)是多少？你覺得操作過程中有哪些地方會(huì)帶來誤差？有哪些操作或參數(shù)還可以優(yōu)化?答：1.內(nèi)標(biāo)法R = 0.99952，線性關(guān)系較好，外標(biāo)法 R = 0.99642，線性關(guān)系也較好，但比內(nèi)標(biāo)法稍差。內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法。2.在如下幾個(gè)方面可能存在實(shí)驗(yàn)誤差:試劑本身的誤差：由于樣品長時(shí)間使用，可能會(huì)分解、揮發(fā)等，造成濃度與剛配置時(shí)有一定誤差, 不過應(yīng)該影響不大；相對(duì)可能影響較大的是，在測量的過程中標(biāo)液在量取后，溶液中的氯仿可能揮 發(fā)（氯仿沸點(diǎn)低），造成濃度變化。配制溶液中的人為誤差：移取溶液、定容不可避免的會(huì)有人為誤差，可能造成某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 準(zhǔn)確度較差；另外，溶液混勻可能不充分，對(duì)

12、測定也有一定影響；配制溶液時(shí)使用移液槍，雖精度 較高，但可能存槍老化等問題導(dǎo)致其精密度下降，而內(nèi)標(biāo)法對(duì)溶液濃度的要求較高，故可能導(dǎo)致誤 差的出現(xiàn)。進(jìn)樣時(shí)的誤差：量取 1.00卩L注入氣相色譜儀的量可能有誤差（對(duì)外標(biāo)法有較大影響）；另外,GC中手動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)的熟練與否也影響到分析結(jié)果的好壞。儀器本身的誤差：峰出現(xiàn)拖尾、分裂等情況會(huì)對(duì)峰面積計(jì)算有影響，且有噪音影響，而且同一個(gè)樣 品測量結(jié)果也會(huì)有不小的誤差，說明儀器本身有一定的誤差。3. 優(yōu)化方式: 操作方面，用較為準(zhǔn)確的微量注射器或者移液槍來移取溶液，提高配制溶液的濃度準(zhǔn)確度；或者增加梯度濃度組，提高線性相關(guān)度，減小誤差。 樣品方面，將待測的未知樣

13、品中蘑菇醇的濃度提高一些，使之落在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線正中間，提高準(zhǔn)確性。 儀器方面：若實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品中各物質(zhì)的峰分離不完全，可選擇降低柱箱升溫速率，減少色譜柱流量，增大進(jìn)樣口分流比，或減小進(jìn)樣量，若還是無法分離，則需考慮改換極性更強(qiáng)的色譜柱。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整2、比較歸一化法，外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。答：1. 歸一化法：優(yōu)點(diǎn)：與進(jìn)樣的準(zhǔn)確性無關(guān)，與儀器和分析條件有關(guān)；缺點(diǎn)：2. 外標(biāo)法：操作條件略有變動(dòng)或進(jìn)樣量控制不十分精確對(duì)分析結(jié)果影響都很小定量計(jì)算必須先知道各成分的校正因子，校正因子的得出較麻煩；所有有效組分必須出峰，且所有組分必須在一個(gè)分析周期內(nèi)流出色譜峰；優(yōu)點(diǎn)：簡便，適用范圍廣

14、；只關(guān)注待測成分出峰，不需要所有成分出峰。缺點(diǎn)：必須有被測組分的純品作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物；此方法準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響； 若響應(yīng)值與試樣的濃度或含量沒有線性關(guān)系，則需要大量的校正數(shù)據(jù)且誤差較大。3. 內(nèi)標(biāo)法：優(yōu)點(diǎn)：定量測量較準(zhǔn)確，其結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無關(guān)；只需要內(nèi)標(biāo)物與被測物出峰，達(dá)到一定的分離度即可；缺點(diǎn)：常用于未知樣品的 GC 定量檢測以及微量成分含量檢測。內(nèi)標(biāo)物需要跟待測組分在同樣條件下出峰，且分離度較好，所以內(nèi)標(biāo)物的選擇較困難；配置較麻煩；3、你對(duì)本實(shí)驗(yàn)有什么意見或建議嗎？答： 由于內(nèi)標(biāo)法對(duì)樣品制備的要求較高，在配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)可以配置兩組，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，可以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可

15、靠度； 實(shí)驗(yàn)中所用到的氯苯、乙腈等試劑有一定的毒性，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意操作規(guī)范和實(shí)驗(yàn)安全，配置溶液時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，提供手套口罩等； 本實(shí)驗(yàn)的溶液配制及儀器操作均較較簡單，在實(shí)驗(yàn)過程中有很長的等待時(shí)間，儀器的操作一人即可完成，實(shí)驗(yàn)室有 4 臺(tái)儀器，可以考慮將儀器全部投入使用，可以使小組四位同學(xué)均在實(shí)驗(yàn)中得到鍛煉。討論與體會(huì)】氣相色譜法是化學(xué)學(xué)科特別是有機(jī)化學(xué)中分離、表征物相的基本表征手段之一，實(shí)驗(yàn)原理較簡單，操作也較輕松，但想要得到良好的線性內(nèi)標(biāo)曲線并不容易。通過氣相色譜技術(shù)，定性、定量分析了奶茶中的香蘭素的含量。下面是本實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)：1、本實(shí)驗(yàn)主要是上機(jī)操作，所以實(shí)驗(yàn)前最好預(yù)習(xí)相關(guān)操作，在助教老師講解時(shí)認(rèn)真聽講、熟悉操作過程；2、進(jìn)樣時(shí)要特別注意：取樣后，一手持注射器，另一只手保護(hù)針尖，防止插入隔墊時(shí)彎曲）。先小心地將注射針頭穿過隔墊，隨即快速將注射器插到底，并將樣品輕輕注入氣化室，同時(shí)按