實(shí)驗(yàn)4氨基酸類物質(zhì)的熒光光譜分析

1、氨基酸類物質(zhì)的熒光光譜分析【摘要】熒光物質(zhì)吸收特定頻率輻射能量后會(huì)產(chǎn)生熒光,不同熒光物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)、最大激發(fā)波長(zhǎng)以及熒光譜圖不同，以此可以鑒定未知物質(zhì)。熒光還與物質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系,可以通過(guò)測(cè)定未知濃度的已知物熒光吸收強(qiáng)度來(lái)測(cè)定濃度?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?熟悉熒光分析法的基本原理;2、了解RF£301型熒光分光光度計(jì)的構(gòu)造、原理，掌握熒光分析法的基本操作;3、掌握熒光分析技術(shù)應(yīng)用于定量分析的原理及方法?！净驹怼?原理概述：利用熒光物質(zhì)分子在吸收特定頻率輻射能量后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)，在溶液中以熱的形式損失部分能量后回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射形式

2、去活化躍遷到電子基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)，便產(chǎn)生熒光。-熒光的產(chǎn)生：熒光物質(zhì)分子在吸收特定頻率輻射能量后，由基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)（或更高激發(fā)態(tài)）的任一振動(dòng)能級(jí)，在溶液中這種激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞，以熱的形式損失部分能量后,而回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)（無(wú)輻射躍遷）。然后再以輻射形式去活化躍遷到電子基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)，便產(chǎn)生熒光。能產(chǎn)生強(qiáng)熒光的物質(zhì)分子，一般都具有大的共軛n鍵結(jié)構(gòu)或具有剛性平面結(jié)構(gòu)等特征。-發(fā)射光譜與吸收光譜:-熒光分析法的特點(diǎn):優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、選擇性好、工作曲線線性范圍寬，能提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光壽命、量子產(chǎn)率、熒光偏振等諸多信息;缺點(diǎn)：由于能夠產(chǎn)生強(qiáng)

3、熒光的物質(zhì)相對(duì)較少，熒光分析法的應(yīng)用不太廣泛;改進(jìn)：對(duì)于沒(méi)有強(qiáng)熒光或沒(méi)有熒光的物質(zhì)的測(cè)定可設(shè)計(jì)相應(yīng)的反應(yīng)使其生成具有熒光特性的配合物進(jìn)行測(cè)定。-氨基酸：含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。色氨酸(Try )、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中僅有能發(fā) 射熒光的組分，可以用熒光法測(cè)定?！緝x器與試劑】1、儀器：F-4600型熒光分光光度計(jì)，10 mL帶玻璃塞的比色管 10只，移液管2、試劑：標(biāo)準(zhǔn)溶液a：標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液c：S射單圖1熒光光譜儀結(jié)構(gòu)示意圖4X10-4mg/mL的酪氨酸溶液;xiO-'mg/m

4、L的苯丙氨酸溶液;xiOmg/mL的色氨酸溶液;色氨酸待測(cè)樣;去離子水?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1、配制實(shí)驗(yàn)樣品:中各溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并確定各自的尼mmax 禾口 尼xmax。(1)分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液 a、標(biāo)準(zhǔn)溶液b和色氨酸待測(cè)樣于 10 mL比色管中，待用。(2)分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液c于7個(gè)10 mL比色管中，并用去離子水稀釋、定容，搖勻，待用。2、儀器操作:(1 )打開計(jì)算機(jī)和分光光度計(jì)主機(jī)，雙擊分光光度計(jì)圖標(biāo)FLSolutions等,系統(tǒng)自檢結(jié)束。預(yù)熱15-30分鐘待儀器穩(wěn)定后方可使用。（2）選擇光譜測(cè)量界面（ 一Method”Gener

5、al IIMeasurementllWavelengths,a繪制上述步驟（1）Is值，然后在相同條件(3)選擇定量測(cè)定界面( 一Method- Gen eraNMeasureme nt-photometry )11,依據(jù)上述步驟中測(cè)得的酪氨酸的 尼mmax和尼xmax，設(shè)定定量測(cè)定的參數(shù)，測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度 下測(cè)量未知樣的相對(duì)熒光強(qiáng)度 lx,并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?！緮?shù)據(jù)處理與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1、色氨酸的熒光分析:調(diào)整狹縫寬度至最佳值：dex=5.0nm , dem=5.0nm。首先預(yù)掃。取 尼m=350nm,得到激發(fā)光譜如圖2:色氨酸激發(fā)光譜25002000 -度 強(qiáng) 光 熒15001000

6、 -500 -200220240260280300波長(zhǎng)(nm)圖2色氨酸激發(fā)光譜320180340選擇最大強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)約220nm處，得到色氨酸的發(fā)射光譜:30002500色氨酸發(fā)射光譜度強(qiáng)光熒1500 -1000 -5000 -240260280300320340360380400420440波長(zhǎng)(nm)2、圖3色氨酸發(fā)射光譜由色氨酸的發(fā)射光譜可以看到，色氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)在348nm左右。酪氨酸的熒光分析:取 尼m=301 nm,得到激發(fā)光譜如圖 4:70006000 -5000 -酪氨酸激發(fā)光譜度強(qiáng)光熒4000 -3000 -由酪氨酸的發(fā)射光譜可以看到,酪氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)在303nm

7、左右。2000 1000 -200220240260波長(zhǎng)(nm)280300圖4酪氨酸激發(fā)光譜選擇最大強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)約225nm處，得到酪氨酸的發(fā)射光譜:酪氨酸發(fā)射光譜7000 =6000 -5000 -度強(qiáng)光熒4000 =3000 -2000 -1000 -1000 +=240260280300320340360380400420波長(zhǎng)(nm)圖5酪氨酸發(fā)射光譜3、苯丙氨酸的熒光分析:取 尼m=383nm,得到激發(fā)光譜如圖由苯丙氨酸的發(fā)射光譜可以看到，苯丙氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)在283nm左右。2500 -2000 -苯丙氨酸激發(fā)光譜度強(qiáng)光熒1500 -1000 -500 -25026027019

8、0200210220230240波長(zhǎng)(nm)圖6苯丙氨酸激發(fā)光譜選擇最大強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)約208nm處，得到苯丙氨酸的發(fā)射光譜苯丙氨酸發(fā)射光譜2500 =2000 -度強(qiáng)光熒1500 -1000 -500 -240260280300320波長(zhǎng)(nm)340360圖7苯丙氨酸發(fā)射光譜4、700060005000 -度強(qiáng)光熒40003000 -2000 -1000 -色氨酸酪氨酸苯丙氨酸將測(cè)得的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的激發(fā)光譜疊加在一個(gè)坐標(biāo)系中:大發(fā)射波長(zhǎng)在 303nm左右。180200220240260280300320340波長(zhǎng)(nm)圖8三種氨基酸的激發(fā)光譜從圖8可知，苯丙氨酸的最大激發(fā)

9、波長(zhǎng)在210nm左右，另外在 257nm處也有峰值；酪氨酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)在225nm左右，另外在 275nm處也有峰值；色氨酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)在221 nm左右，另外在 275nm處也有峰值。酪氨酸和色氨酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)比較接近。7000 -6000 -色氨酸酪氨酸苯丙氨酸5000 -度強(qiáng)光熒4000 =3000 -2000 -1000 -1000250300350波長(zhǎng)(nm)400450圖9三種氨基酸的發(fā)射光譜從圖9可知，苯丙氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)在283nm左右，色氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)在348nm左右，酪氨酸的最F面從理論分析不同氨基酸具有不同最大激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)的原因:如圖為三種氨基酸的結(jié)構(gòu):CO

10、O- + !HaNCHCH,COO- + I HN-CH1COO- + I HgN-C-H苯丙氨酸圖10三種氨基酸的結(jié)構(gòu)根據(jù)測(cè)得的熒光數(shù)據(jù)：最大發(fā)射波長(zhǎng)Emmax：苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸，最大激發(fā)波長(zhǎng)尼xmax：苯丙氨酸酪氨酸色氨酸。三種氨基酸均具有苯環(huán)、 吲哚環(huán)等大的不飽和基團(tuán)，其中具有吲哚基團(tuán)的色氨酸的不飽和鍵數(shù)量及其面積最大，故發(fā)生紅移，具有最大發(fā)射波長(zhǎng)和最大激發(fā)波長(zhǎng)，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波長(zhǎng)；而酪氨酸中的羥基存在給電子共軛效應(yīng)，其相對(duì)苯丙氨酸發(fā)生了紅移，最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)大于苯丙氨酸。從共軛角度看，體系的共軛度增強(qiáng)，熒光效率一般也增大。這是由于增大了熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù),

11、n電子更容易被激發(fā)，產(chǎn)生了更多的激發(fā)態(tài)分子，使熒光增強(qiáng)。由于不同氨基酸溶液的濃度以及使用的激發(fā)電壓不同，熒光強(qiáng)度不好直接比較。5、色氨酸未知溶液的定量測(cè)量:選擇對(duì)應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng) 220nm和發(fā)射波長(zhǎng)350nm ,狹縫寬度與實(shí)驗(yàn)步驟1的相同：dex=5.0nm , dem=5.0nm。根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液的熒光強(qiáng)度Is及濃度C,繪制ISP工作曲線，如圖10：度 強(qiáng) 光 熒Lin ear Fit of Sheet1 B"熒光強(qiáng)度"/ *BEquati ony = a + b*xPlot熒光強(qiáng)度- /WeightNo Weighti ng-In terce pt96.62357 ?

12、37.87238Slo pe408.09786 ?10.50391/Residual Sum of Squares15446.49221Pears on's r0.99835R-Square(COD)0.9967Adj. R-Square0.996041.1r1r1 " 1 ' 1 1 25002000150010005000156熒光強(qiáng)度234濃度(>10人-4 mg/ml)0圖11色氨酸Is -c工作曲線由線性擬合得出線性方程強(qiáng)度 Is = 408.9786 c + 96.62357，相關(guān)度 R2=0.99604 ，擬合效果較好，測(cè)量未知色氨酸溶液的熒光強(qiáng)度

13、 Ix=1 1 37 ，代入線性方程，得到其濃度為2.544 >10-4mgmL-1。1、思考題】本實(shí)驗(yàn)中定量測(cè)定的條件參數(shù)是如何選擇的，為什么？答：定量測(cè)定的條件參數(shù)有：激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)，狹縫寬度dex, dem；通過(guò)預(yù)掃以及激發(fā)光譜和發(fā)射光譜ex的熒光測(cè)試，確定了這些參數(shù)。其中狹縫寬度與前面定性測(cè)量尋找最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)所使用的寬度致，選擇的激發(fā)波長(zhǎng)為最大激發(fā)波長(zhǎng)，選擇的發(fā)射波長(zhǎng)為最大發(fā)射波長(zhǎng)（近似為整數(shù)值）。2、影響熒光特性的因素有哪些？請(qǐng)列舉說(shuō)明。答：（ 1）具有至少一個(gè)芳環(huán)或多個(gè)共軛雙鍵的物質(zhì)一般具有熒光，具有剛性結(jié)構(gòu)的共軛體系的熒光更強(qiáng)；-OH 、 -NH 2）會(huì)使熒光

14、增強(qiáng)，2）取代基的性質(zhì)：芳環(huán)上的取代基會(huì)引起熒光峰的改變，給電子基（最大吸收波長(zhǎng)紅移；吸電子基（-N02、-CI）會(huì)使熒光減弱，使最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移甚至熒光消失;4）大部分無(wú)機(jī)鹽金屬離子不產(chǎn)生熒光，而金屬螯合物常具有很強(qiáng)的熒光；溶劑的性質(zhì)：例如有機(jī)物和金屬的有機(jī)絡(luò)合物，在乙醇溶液中的熒光比在水中強(qiáng)；溫度：溶液溫度下降時(shí)，介質(zhì)的粘度變大，熒光物質(zhì)與分子碰撞減小，熒光增強(qiáng)；溫度升高，熒光減弱；6）pH :例如酚羥基、氨基等，在不同酸堿性下會(huì)有不同的存在形式：酚羥基在堿性條件下變?yōu)?O-，給電子能力加強(qiáng),使最大吸收波長(zhǎng)紅移； -NH 2在酸性條件下變?yōu)?-NH 3+,從給電子基團(tuán)變?yōu)槲娮踊鶊F(tuán)，使最大

15、吸收波長(zhǎng)藍(lán)移、熒光減弱甚至消失；根據(jù)常規(guī)的熒光法能夠?qū)崿F(xiàn)混合物中這三種氨基酸的分別測(cè)定嗎？若能，請(qǐng)說(shuō)明原因；若不能，請(qǐng)?zhí)岢隹尚械臏y(cè)定方案。pH 為 7.4 左右）、稀釋后，選擇一定的答：不能，因?yàn)檫@三種氨基酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)有一定交集，相互重疊，即熒光測(cè)量時(shí)產(chǎn)生的峰會(huì)相互影響；可能的方案：通過(guò)同步熒光法，即在混合溶液中加入緩沖液（ 入（一般在55nm左右），通過(guò)等波長(zhǎng)差同步掃描的方法得到熒光光譜，再將光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理, 可得到三種氨基酸的最大吸收波長(zhǎng)。討論與體會(huì)】實(shí)驗(yàn)原理較簡(jiǎn)單， 操作也較輕松， 通過(guò)熒光分熒光分析實(shí)驗(yàn)是表征含不飽和鍵化合物常用的分析手段之一， 析法定性、定量分析了三種含苯環(huán)

16、氨基酸的最大激發(fā)波長(zhǎng)、最大發(fā)射波長(zhǎng)，并確定了未知色氨酸溶液的濃度。面是本實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)與體會(huì)：測(cè)試前應(yīng)該進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)，要清楚實(shí)驗(yàn)下一步要做什么； 從預(yù)掃描可以得到激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的初步結(jié)果，利用我們得到的初步結(jié)果對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，然后再測(cè) 量它們的熒光激發(fā)、發(fā)射熒光光譜； 要注意譜圖中在固定的波長(zhǎng)附近會(huì)有瑞利散射峰，只要改變固定的波長(zhǎng)瑞利散射峰也會(huì)改變，不要與 熒光的吸收峰弄混 比色皿要清洗干凈，保證對(duì)氨基酸溶液熒光光譜測(cè)定的準(zhǔn)確性； 本實(shí)驗(yàn)在使用移液管移取氨基酸溶液的過(guò)程中，鍛煉了我們認(rèn)真耐心、一絲不茍的態(tài)度，回顧了基礎(chǔ)分析化學(xué)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作；在處理數(shù)據(jù)和作圖的過(guò)程中，提高了我們處理數(shù)據(jù)和定量分析