實驗4氨基酸類物質(zhì)的熒光光譜分析

1、氨基酸類物質(zhì)的熒光光譜分析【摘要】熒光物質(zhì)吸收特定頻率輻射能量后會產(chǎn)生熒光,不同熒光物質(zhì)的最大吸收波長、最大激發(fā)波長以及熒光譜圖不同，以此可以鑒定未知物質(zhì)。熒光還與物質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系,可以通過測定未知濃度的已知物熒光吸收強度來測定濃度?！緦嶒?zāi)康摹?熟悉熒光分析法的基本原理;2、了解RF£301型熒光分光光度計的構(gòu)造、原理，掌握熒光分析法的基本操作;3、掌握熒光分析技術(shù)應(yīng)用于定量分析的原理及方法?！净驹怼?原理概述：利用熒光物質(zhì)分子在吸收特定頻率輻射能量后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的任一振動能級，在溶液中以熱的形式損失部分能量后回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射形式

2、去活化躍遷到電子基態(tài)的任一振動能級，便產(chǎn)生熒光。-熒光的產(chǎn)生：熒光物質(zhì)分子在吸收特定頻率輻射能量后，由基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)（或更高激發(fā)態(tài)）的任一振動能級，在溶液中這種激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞，以熱的形式損失部分能量后,而回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級（無輻射躍遷）。然后再以輻射形式去活化躍遷到電子基態(tài)的任一振動能級，便產(chǎn)生熒光。能產(chǎn)生強熒光的物質(zhì)分子，一般都具有大的共軛n鍵結(jié)構(gòu)或具有剛性平面結(jié)構(gòu)等特征。-發(fā)射光譜與吸收光譜:-熒光分析法的特點:優(yōu)點：靈敏度高、選擇性好、工作曲線線性范圍寬，能提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、發(fā)光強度、發(fā)光壽命、量子產(chǎn)率、熒光偏振等諸多信息;缺點：由于能夠產(chǎn)生強

3、熒光的物質(zhì)相對較少，熒光分析法的應(yīng)用不太廣泛;改進：對于沒有強熒光或沒有熒光的物質(zhì)的測定可設(shè)計相應(yīng)的反應(yīng)使其生成具有熒光特性的配合物進行測定。-氨基酸：含有氨基和羧基的一類有機化合物，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。色氨酸(Try )、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中僅有能發(fā) 射熒光的組分，可以用熒光法測定?！緝x器與試劑】1、儀器：F-4600型熒光分光光度計，10 mL帶玻璃塞的比色管 10只，移液管2、試劑：標準溶液a：標準溶液標準溶液c：S射單圖1熒光光譜儀結(jié)構(gòu)示意圖4X10-4mg/mL的酪氨酸溶液;xiO-'mg/m

4、L的苯丙氨酸溶液;xiOmg/mL的色氨酸溶液;色氨酸待測樣;去離子水。【實驗步驟】1、配制實驗樣品:中各溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并確定各自的尼mmax 禾口 尼xmax。(1)分別移取標準溶液 a、標準溶液b和色氨酸待測樣于 10 mL比色管中，待用。(2)分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL標準溶液c于7個10 mL比色管中，并用去離子水稀釋、定容，搖勻，待用。2、儀器操作:(1 )打開計算機和分光光度計主機，雙擊分光光度計圖標FLSolutions等,系統(tǒng)自檢結(jié)束。預(yù)熱15-30分鐘待儀器穩(wěn)定后方可使用。（2）選擇光譜測量界面（ 一Method”Gener

5、al IIMeasurementllWavelengths,a繪制上述步驟（1）Is值，然后在相同條件(3)選擇定量測定界面( 一Method- Gen eraNMeasureme nt-photometry )11,依據(jù)上述步驟中測得的酪氨酸的 尼mmax和尼xmax，設(shè)定定量測定的參數(shù)，測定系列標準溶液的熒光強度 下測量未知樣的相對熒光強度 lx,并記錄實驗數(shù)據(jù)?！緮?shù)據(jù)處理與實驗結(jié)果分析】1、色氨酸的熒光分析:調(diào)整狹縫寬度至最佳值：dex=5.0nm , dem=5.0nm。首先預(yù)掃。取 尼m=350nm,得到激發(fā)光譜如圖2:色氨酸激發(fā)光譜25002000 -度 強 光 熒15001000

6、 -500 -200220240260280300波長(nm)圖2色氨酸激發(fā)光譜320180340選擇最大強度對應(yīng)的波長約220nm處，得到色氨酸的發(fā)射光譜:30002500色氨酸發(fā)射光譜度強光熒1500 -1000 -5000 -240260280300320340360380400420440波長(nm)2、圖3色氨酸發(fā)射光譜由色氨酸的發(fā)射光譜可以看到，色氨酸的最大發(fā)射波長在348nm左右。酪氨酸的熒光分析:取 尼m=301 nm,得到激發(fā)光譜如圖 4:70006000 -5000 -酪氨酸激發(fā)光譜度強光熒4000 -3000 -由酪氨酸的發(fā)射光譜可以看到,酪氨酸的最大發(fā)射波長在303nm

7、左右。2000 1000 -200220240260波長(nm)280300圖4酪氨酸激發(fā)光譜選擇最大強度對應(yīng)的波長約225nm處，得到酪氨酸的發(fā)射光譜:酪氨酸發(fā)射光譜7000 =6000 -5000 -度強光熒4000 =3000 -2000 -1000 -1000 +=240260280300320340360380400420波長(nm)圖5酪氨酸發(fā)射光譜3、苯丙氨酸的熒光分析:取 尼m=383nm,得到激發(fā)光譜如圖由苯丙氨酸的發(fā)射光譜可以看到，苯丙氨酸的最大發(fā)射波長在283nm左右。2500 -2000 -苯丙氨酸激發(fā)光譜度強光熒1500 -1000 -500 -25026027019

8、0200210220230240波長(nm)圖6苯丙氨酸激發(fā)光譜選擇最大強度對應(yīng)的波長約208nm處，得到苯丙氨酸的發(fā)射光譜苯丙氨酸發(fā)射光譜2500 =2000 -度強光熒1500 -1000 -500 -240260280300320波長(nm)340360圖7苯丙氨酸發(fā)射光譜4、700060005000 -度強光熒40003000 -2000 -1000 -色氨酸酪氨酸苯丙氨酸將測得的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的激發(fā)光譜疊加在一個坐標系中:大發(fā)射波長在 303nm左右。180200220240260280300320340波長(nm)圖8三種氨基酸的激發(fā)光譜從圖8可知，苯丙氨酸的最大激發(fā)

9、波長在210nm左右，另外在 257nm處也有峰值；酪氨酸的最大激發(fā)波長在225nm左右，另外在 275nm處也有峰值；色氨酸的最大激發(fā)波長在221 nm左右，另外在 275nm處也有峰值。酪氨酸和色氨酸的最大激發(fā)波長比較接近。7000 -6000 -色氨酸酪氨酸苯丙氨酸5000 -度強光熒4000 =3000 -2000 -1000 -1000250300350波長(nm)400450圖9三種氨基酸的發(fā)射光譜從圖9可知，苯丙氨酸的最大發(fā)射波長在283nm左右，色氨酸的最大發(fā)射波長在348nm左右，酪氨酸的最F面從理論分析不同氨基酸具有不同最大激發(fā)、發(fā)射波長的原因:如圖為三種氨基酸的結(jié)構(gòu):CO

10、O- + !HaNCHCH,COO- + I HN-CH1COO- + I HgN-C-H苯丙氨酸圖10三種氨基酸的結(jié)構(gòu)根據(jù)測得的熒光數(shù)據(jù)：最大發(fā)射波長Emmax：苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸，最大激發(fā)波長尼xmax：苯丙氨酸酪氨酸色氨酸。三種氨基酸均具有苯環(huán)、 吲哚環(huán)等大的不飽和基團，其中具有吲哚基團的色氨酸的不飽和鍵數(shù)量及其面積最大，故發(fā)生紅移，具有最大發(fā)射波長和最大激發(fā)波長，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波長；而酪氨酸中的羥基存在給電子共軛效應(yīng)，其相對苯丙氨酸發(fā)生了紅移，最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長大于苯丙氨酸。從共軛角度看，體系的共軛度增強，熒光效率一般也增大。這是由于增大了熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù),

11、n電子更容易被激發(fā)，產(chǎn)生了更多的激發(fā)態(tài)分子，使熒光增強。由于不同氨基酸溶液的濃度以及使用的激發(fā)電壓不同，熒光強度不好直接比較。5、色氨酸未知溶液的定量測量:選擇對應(yīng)激發(fā)波長 220nm和發(fā)射波長350nm ,狹縫寬度與實驗步驟1的相同：dex=5.0nm , dem=5.0nm。根據(jù)系列標準酪氨酸溶液的熒光強度Is及濃度C,繪制ISP工作曲線，如圖10：度 強 光 熒Lin ear Fit of Sheet1 B"熒光強度"/ *BEquati ony = a + b*xPlot熒光強度- /WeightNo Weighti ng-In terce pt96.62357 ?

12、37.87238Slo pe408.09786 ?10.50391/Residual Sum of Squares15446.49221Pears on's r0.99835R-Square(COD)0.9967Adj. R-Square0.996041.1r1r1 " 1 ' 1 1 25002000150010005000156熒光強度234濃度(>10人-4 mg/ml)0圖11色氨酸Is -c工作曲線由線性擬合得出線性方程強度 Is = 408.9786 c + 96.62357，相關(guān)度 R2=0.99604 ，擬合效果較好，測量未知色氨酸溶液的熒光強度

13、 Ix=1 1 37 ，代入線性方程，得到其濃度為2.544 >10-4mgmL-1。1、思考題】本實驗中定量測定的條件參數(shù)是如何選擇的，為什么？答：定量測定的條件參數(shù)有：激發(fā)波長，發(fā)射波長，狹縫寬度dex, dem；通過預(yù)掃以及激發(fā)光譜和發(fā)射光譜ex的熒光測試，確定了這些參數(shù)。其中狹縫寬度與前面定性測量尋找最大激發(fā)波長和發(fā)射波長所使用的寬度致，選擇的激發(fā)波長為最大激發(fā)波長，選擇的發(fā)射波長為最大發(fā)射波長（近似為整數(shù)值）。2、影響熒光特性的因素有哪些？請列舉說明。答：（ 1）具有至少一個芳環(huán)或多個共軛雙鍵的物質(zhì)一般具有熒光，具有剛性結(jié)構(gòu)的共軛體系的熒光更強；-OH 、 -NH 2）會使熒光

14、增強，2）取代基的性質(zhì)：芳環(huán)上的取代基會引起熒光峰的改變，給電子基（最大吸收波長紅移；吸電子基（-N02、-CI）會使熒光減弱，使最大吸收波長藍移甚至熒光消失;4）大部分無機鹽金屬離子不產(chǎn)生熒光，而金屬螯合物常具有很強的熒光；溶劑的性質(zhì)：例如有機物和金屬的有機絡(luò)合物，在乙醇溶液中的熒光比在水中強；溫度：溶液溫度下降時，介質(zhì)的粘度變大，熒光物質(zhì)與分子碰撞減小，熒光增強；溫度升高，熒光減弱；6）pH :例如酚羥基、氨基等，在不同酸堿性下會有不同的存在形式：酚羥基在堿性條件下變?yōu)?O-，給電子能力加強,使最大吸收波長紅移； -NH 2在酸性條件下變?yōu)?-NH 3+,從給電子基團變?yōu)槲娮踊鶊F，使最大

15、吸收波長藍移、熒光減弱甚至消失；根據(jù)常規(guī)的熒光法能夠?qū)崿F(xiàn)混合物中這三種氨基酸的分別測定嗎？若能，請說明原因；若不能，請?zhí)岢隹尚械臏y定方案。pH 為 7.4 左右）、稀釋后，選擇一定的答：不能，因為這三種氨基酸的最大發(fā)射波長有一定交集，相互重疊，即熒光測量時產(chǎn)生的峰會相互影響；可能的方案：通過同步熒光法，即在混合溶液中加入緩沖液（ 入（一般在55nm左右），通過等波長差同步掃描的方法得到熒光光譜，再將光譜進行一階導(dǎo)數(shù)處理, 可得到三種氨基酸的最大吸收波長。討論與體會】實驗原理較簡單， 操作也較輕松， 通過熒光分熒光分析實驗是表征含不飽和鍵化合物常用的分析手段之一， 析法定性、定量分析了三種含苯環(huán)

16、氨基酸的最大激發(fā)波長、最大發(fā)射波長，并確定了未知色氨酸溶液的濃度。面是本實驗的一些經(jīng)驗教訓(xùn)與體會：測試前應(yīng)該進行充分的預(yù)習，要清楚實驗下一步要做什么； 從預(yù)掃描可以得到激發(fā)和發(fā)射波長的初步結(jié)果，利用我們得到的初步結(jié)果對參數(shù)進行設(shè)置，然后再測 量它們的熒光激發(fā)、發(fā)射熒光光譜； 要注意譜圖中在固定的波長附近會有瑞利散射峰，只要改變固定的波長瑞利散射峰也會改變，不要與 熒光的吸收峰弄混 比色皿要清洗干凈，保證對氨基酸溶液熒光光譜測定的準確性； 本實驗在使用移液管移取氨基酸溶液的過程中，鍛煉了我們認真耐心、一絲不茍的態(tài)度，回顧了基礎(chǔ)分析化學(xué)的相關(guān)實驗操作；在處理數(shù)據(jù)和作圖的過程中，提高了我們處理數(shù)據(jù)和定量分析