碧云天的突變試劑盒說明書

1、基因定點突變試劑盒 產品簡介:碧云天生產的基因定點突變試劑盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit可以用于點突變,多個鄰近密碼子的突變,單個或多個鄰近密碼子的缺失(deletion或插入(insertion。本試劑盒是一個利用目前最新的基因點突變技術設計而成的試劑盒。只需通過基于PCR的突變質粒的合成,和基于Dpn I的模板質粒的消化,轉化培養(yǎng)以及后續(xù)的酶切或測序鑒定,即可得到預期的突變質粒(參考圖1。累計操作時間不足2小時即可完成基因的定點突變。參考圖1,使用本試劑盒時需要先設計長度通常為30個堿基以上的互補的兩個引物,在引物中含有預期的突變位點。然后以待突變

2、的質粒為模板,用這兩個引物進行PCR擴增反應。這樣可以產生含有預期的突變位點的雙鏈質粒,但這個雙鏈質粒中有兩個nick位點。待突變的質粒通常來源于大腸桿菌等細菌,在細菌中會被甲基化修飾,而在體外通過PCR擴增得到的質粒不會被甲基化。這樣用甲基化酶Dpn I處理,可以消化掉待突變的質粒模板,而使通過PCR擴增出來的含有突變位點的質粒被選擇性地保留下來。這樣把Dpn I處理過的產物轉化細菌后,質粒中有兩個nick位點可以被大腸桿菌修復,得到的克隆就會含有預期的突變質粒了。本試劑盒提供了DH5甘油菌,可用于感受態(tài)細菌的制備。本試劑盒共可以進行十次基因定點突變反應。圖1. 基因定點突變試劑盒原理圖 保

3、存條件:-20保存,一年有效。注意事項:需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于細菌的培養(yǎng)。需自行設計和合成用于基因定點突變的引物。需自備用于細菌轉化的試劑。使用本試劑盒前請先閱讀后面的常見問題。為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。使用說明:1. 引物設計:用于特定基因突變的引物需要單獨設計,請參考如下一些基本原則進行設計:(1 共需設計兩條互補的引物?？梢韵燃性O計一條,然后就可以得到互補的另一條引物。(2 引物的長度通常為25-45個堿基。(3 引物中突變位點任何一側都必需滿足 4X(GC堿基數(shù)+2X(AT堿基數(shù) 45。但引物也不宜過長,否則通常會形成非常穩(wěn)定的二級結構。通常

4、把突變位點兩側的堿基數(shù)控制在15個左右,且使兩側按照上述計算得到的數(shù)值相近。例如引物為agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag,其中藍色的aag為突變位點,則左側:4X(GC堿基數(shù)+2X(AT堿基數(shù)=4X8+2X7=4645右側:4X(GC堿基數(shù)+2X(AT堿基數(shù)=4X8+2X8=4845(4 在可能的情況下,盡量把引物的GC含量控制在40%-60%。(5 在可能的情況下,盡量使引物不要產生非常穩(wěn)定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可以通過一些軟件進行分析。(6 最好使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。2. 引物的配制:如果合成得到的一個引物A的量

5、是20nmol,另外一個互補引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水,配制成濃度為100µM,在引物B中加入190微升水也配制成濃度為100µM。吸取20微升100µM引物A和20微升100µM引物B到一新的離心管中,再加入160微升水,混勻后即可得到可以直接用于基因定點突變反應的引物(10µM each。3. 待突變模板質粒的選擇:選擇GC含量在40-55%的待突變模板質粒,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果GC含量過高,請先把目的基因克隆到其它合適的載體上,再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量最

6、好也在40-55%的范圍,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果目的基因GC含量過高,而突變位點不在高GC含量區(qū)域,可以先把該基因的不含高GC含量的一個區(qū)域克隆出來,進行定點突變,然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質粒模板,或者有局部高GC含量的質粒模板,請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。必需使用從dam+的大腸桿菌(這類菌中質?？梢员患谆谐樘岬玫降馁|粒用于基因定點突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam+的,包括DH5、JM109等。4. 基因定點突變反應:(1 如下設置基因定點突變反應體系:Nuclease-Free Wate

7、r ?µlReaction Buffer (10X 5µl引物 (10µM each 2µldNTP Mix (2.5mM each 4µl待突變模板質粒(0.5µg ?µl總體積 49µl按照上面的順序依次加入各種試劑。在上述反應體系中,根據(jù)待突變模板質粒的量,計算出需加入的Nuclease-Free Water 的量,使總體積為49微升。適當混勻后,加入 1 ul Pfu DNA Polymerase,混勻。如果用的PCR儀沒有熱蓋,在反應體系上加入一滴礦物油(mineral oil以防止蒸發(fā)。 5.Dpn I

8、消化:PCR反應后,直接在PCR反應體系中加入1微升Dpn I,混勻后37孵育1小時。37孵育可以在PCR儀上進行,也可以在水浴鍋中進行。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化,或者-20保存?zhèn)溆谩?. 轉化、挑克隆鑒定:感受態(tài)細菌的轉化效率必需至少在107以上,否則很難得到克隆。根據(jù)所使用的感受態(tài)細菌,加入盡量多的經過Dpn I消化后的突變產物用于轉化。通常每100微升感受態(tài)細菌中可以加入5-10微升經過Dpn I消化后的突變產物。按照所使用的感受態(tài)細菌的操作方法進行操作,在涂板前通過離心濃縮的辦法,把所有被轉化后的細菌,全部涂布到含有適當抗生素的平板上,培養(yǎng)過夜。通常會得到50個以下的克隆。

9、如果發(fā)現(xiàn)克隆有上千個,那么肯定是有什么地方出了問題。對于得到的克隆,可以先挑克隆小抽酶切鑒定。以確認得到的質粒的大小和質粒中插入片斷的大小與預期結果是否相符。取3-5個酶切鑒定正確的克隆去測序,以最終確認得到的克隆是否是預期的突變克隆。通常大約每2個克隆中會得到一個預期的突變克隆。但有時也可能會因為隨機因素,會測序了3-5個克隆才得到一個預期的突變克隆。常見問題:1.轉化后沒有克隆或克隆數(shù)極少:(1感受態(tài)細菌效率不夠高,請檢測一下感受態(tài)細胞的效率,確保轉化效率在107以上,當然高一些更好。(2把Dpn I消化后的產物用常規(guī)的乙醇沉淀方法進行沉淀,然后溶解在較小的體積中。這樣就可以把所有的產物全

10、部用于轉化。(3優(yōu)化基因定點突變中的PCR參數(shù)。可以把最初的95變性時間延長為2分鐘,循環(huán)中95變性的時間延長至1分鐘,把循環(huán)中的68的延伸時間改為1.5分鐘/kb 至2分鐘/kb,退火可以改為60-55或65-55等的touch down,退火時間也可以適當延長。(4引物設計有問題。通過突變反應中的PCR沒有很好地擴增出預期的突變質粒。(5如果使用礦物油(mineral oil,在轉化時如果把礦物油帶入感受態(tài)菌,會嚴重影響轉化效率。2.有克隆,但沒有或很難檢測到預期的突變克隆:(1Dpn I消化效果不佳。一種可能是加入Dpn I后,由于該酶在甘油中,會迅速下沉,如果沒有混勻就會嚴重影響Dpn

11、 I的消化作用。另一種可能是Dpn I由于保存不當或保存時間過長等原因導致活性下降,這時可以適當延長消化的時間至1.5-2小時。(2使用的待突變的模板質粒量過多,導致Dpn I消化時不完全。我們這里推薦的模板質粒用量0.5微克,已經是模板質粒用量的上限,不能再使用更多的模板質粒了。(3盡量避免多次反復凍融dNTP?？梢园裠NTP適當分裝后再使用。3.有突變克隆,但突變位點不是預期的位點:(1引物設計不佳,并且PCR反應中退火溫度過低,導致引物退火到錯誤的地方。(2引物質量較差,沒有經過PAGE純化。這樣引物中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物,容易導致非預期的突變。使用本產品的文獻:

12、1. Song ZB, Bao YL, Zhang Y, Mi XG, Wu P, Wu Y, Yu CL, Sun Y, Zheng LH, Huang YX, Liu B, Li YXTestes-specific pro tease 50 (TSP50 promotes cell proliferation through the activation of thenuclear factor B (NF-B signalling pathway.Biochem J. 2011 Jun 1;436(2:457-67.2. Li YY, Bao YL, Song ZB, Sun LG, W

13、u P, Zhang Y, Fan C, Huang YX, Wu Y, Yu CL, Sun Y, Zheng LH, Wang GN, Li YX.The threonine protease activity of testes-specific protease 50 (TSP50 is essential for its functionin cell proliferation.PLoS One. 2012;7(5:e350303. Fei X, Qi M, Wu B, Song Y, Wang Y, Li T.MicroRNA-195-5p suppresses glucose

14、uptake and proliferation of human bladder cancer T24 cellsby regulating GLUT3 expression.FEBS Lett. 2012 Feb 17;586(4:392-7.4. Li F, Jiang Z, Wang K, Guo J, Hu G, Sun L, Wang T, Tang X, He L, Yao J, Wen D, Qin X, Zhang LTransactivation of the human NME5 gene by Sp1 in pancreatic cancer cells.Gene. 2

15、012 Jul 25;503(2:200-7.5. Qin Y, Fang Z, Pan F, Zhao Y, Li H, Wu H, Meng XSignificance of Tyr302, His235 and Asp194 in the -amylase from Bacillus licheniformis.Biotechnol Lett. 2012 May;34(5:895-9.6. Guo CJ, Yang LS, Zhang YF, Wu YY, Weng SP, Yu XQ, He JG.A novel viral SOCS from infectious spleen an

16、d kidney necrosis virus: interacts with Jak1 and inhibits IFN-induced Stat1/3 activation.7. Liu Y, Zhang C, Chen J, Guo L, Li X, Li W, Yu Z, Deng J, Zhang P, Zhang K, Zhang LArabidopsis heat shock factor HsfA1a directly senses heat stress, pH changes, and hydrogen peroxide via theengagement of redox

17、 state.8. Li X, Lu Y, Chen Y, Lu W, Xie X.MicroRNA profile of paclitaxel-resistant serous ovarian carcinoma based on formalin-fixed paraffin-embeddedsamples.9. Guan Y, Guo L, Yang E, Liao Y, Liu L, Che Y, Zhang Y, Wang L, Wang J, Li Q.HSV-1 nucleocapsid egress mediated by UL31 in association with UL

18、34 is impeded by cellular transmembrane protein 140.10.Wang G, Sai K, Gong F, Yang Q, Chen F, Lin J.11.Zhao H, Li H, Du W, Zhang D, Ge J, Xue F, Zhou Z, Yang R.Reduced MIR130A is involved in primary immune thrombocytopenia via targeting TGFB1 and IL18.12.Zhang XW, Zhang BY, Wang SW, Gong DJ, Han L,

19、Xu ZY, Liu XH.Twist-related protein 1 negatively regulated osteoblastic transdifferentiation of human aortic valve interstitial cells by directly inhibiting runt-related transcription factor 2.13.Liu Y, Zhou J, Pan JA, Mabiala P, Guo D.A novel approach to block HIV-1 coreceptor CXCR4 in non-toxic ma

20、nner.14.Jiang W, Min J, Sui X, Qian Y, Liu Y, Liu Z, Zhou H, Li X, Gong Y.MicroRNA-26a-5p and microRNA-23b-3p up-regulate peroxiredoxin III in acute myeloid leukemia.Leuk Lymphoma. 2014 Jun 25:1-12.15.Huang L, Hu X, Zhou M, Yang Y, Qiao J, Wang D, Yu J, Cui Z, Zhang Z, Zhang XE, Wei H.Rapid detection of New Delhi metallo-lactamase gene and variants coding for carbapenemases with different activities by use of a PCR-based in vitro