人肝癌組織中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶異常表達(dá)及其基因甲基化程度的研究

1、人肝癌組織中-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶異常表達(dá)及其基因甲基化程度的研究【摘要】目的探討-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)基因在人類肝癌發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)及改變機(jī)制。方法以病理組織學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，將自身配對(duì)的肝癌、癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織中總RNA純化，對(duì)GGT的表達(dá)與改變進(jìn)行了分析；并設(shè)計(jì)兩套引物，以逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR法擴(kuò)增GGT5-非編碼區(qū)(NC)基因和限制性內(nèi)切酶消化分析了不同肝癌組織中GGT基因的甲基化程度。結(jié)果在病理組織學(xué)證實(shí)的24例肝癌、癌旁和遠(yuǎn)癌組織中：從肝癌灶至遠(yuǎn)癌的不同組織中，總RNA濃度呈逐步升高趨勢(shì)，三種不同組織間的差異均有顯著性(P0.05);癌組織中總GGT比活性(U/g)較癌周和遠(yuǎn)癌組

2、織明顯升高(P0.05);以自行設(shè)計(jì)建立的逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR法，成功地?cái)U(kuò)增GGT的5-NC基因片段，特異性強(qiáng)且區(qū)帶清晰，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切分析證明，GGT基因5-NC M3位點(diǎn)(CCGG)，其內(nèi)位C在癌灶、癌周和遠(yuǎn)癌組織中的低甲基化頻率分別為70.83%,58.33%和54.17%，非常明顯地高于同組中已甲基化程度。結(jié)論肝癌組織中GGT基因甲基化程度較低，且與肝癌GGT的異常表達(dá)關(guān)系密切，對(duì)肝細(xì)胞癌變可能起促進(jìn)作用?！娟P(guān)鍵詞】肝癌-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)RNA甲基化 Abnormal expression and methylation status of -glutamyl transferase

3、 (GGT) genes in human hepatoma tissueTANG Qiyun, YAO Dengfu, LIU Yanhua, et al. The First Hospital, Yancheng City of Jiangsu Prouince, 224001【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of expression and alteration of -glutamyl transferase (GGT) genes during the development of human hepatic carcinom

4、a.MethodsThe total RNA concentration and the expressions and changs of different molecular forms of GGT in the self-controled liver cancerous, paracancerous and distal cancerous tissues were investigated by pathologic examination, biochemical and molecular biological assays. Moreover, the part GGT g

5、enes of the 5-NC region were amplified with two sets of primers by using a nest RT-PCR assay, and methylation status of GGT genes were also studied by a restriction endonuclease RT-PCR technique.ResultsOf the 24 tissue specimens confirmed by pathological examination: An increasing tendency of total

6、RNA concentrations was found from cancer to distal cancerous tissues, and there was a marked difference (P0.05) between those in liver cancers and paracancerous /or distal cancerous tissues; The specific activities (U/g) of total GGT was significantly higher (P0.05) in hepatoma tissues than in those

7、 of paracancerous/or distal cancerous tissues; Analysed by using a restriction endonuclease RT-PCR assay, the inner C of M3-CCGG-site of GGT 5-NC genes in their PCR products showed universal hypomethylation. The frequency of hypomethylated M3 site was 70.83% in hepatomas, 58.33% in paracancerous and

8、 54.17% in distal cancerous tissues and was significantly higher than that of the M3 site methylated cases in the same group.ConclusionsThe hypomethylation status of GGT genes in hepatomas is strongly correlated with the abnormal expression of hepatoma GGT and hypomethylated GGT gene might promote t

9、he liver canceration during hepatocarcinogenesis.【Key words】Hepatoma-GGTGeneExpressionRNAMethylation體內(nèi)-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)既與生物轉(zhuǎn)化、核酸代謝及腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，又是反映肝細(xì)胞惡性病變的靈敏標(biāo)志酶1，2。GGT在胚胎期以肝內(nèi)最多，出生后逐步降至較低水平；當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，肝內(nèi)GGT重新大量表達(dá)，并且出現(xiàn)較明顯的異質(zhì)性改變。已知肝細(xì)胞癌變過(guò)程中，總基因組DNA甲基化水平、部分癌基因及癌相關(guān)基因如c-fos等呈低甲基化狀態(tài)，DNA胞嘧啶殘基的甲基化，特別是CCGG序列內(nèi)位C甲基化狀態(tài)與基

10、因的調(diào)控和表達(dá)有密切關(guān)系3，4，但GGT基因甲基化狀態(tài)與肝癌發(fā)生之間有何關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)分析人肝癌組織中總RNA濃度、酶蛋白表達(dá)和對(duì)GGT基因進(jìn)行擴(kuò)增觀察其甲基化程度，試從分子水平來(lái)探討細(xì)胞癌變機(jī)制。材料與方法一、研究對(duì)象收集1997年7月1998年4月外科手術(shù)新鮮肝組織標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)自南通醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及江蘇省鹽城市第一、第二人民醫(yī)院，分別留取肝癌組織、癌周組織及遠(yuǎn)癌組織各24份，各約200mg，取部分肝組織作病理學(xué)檢查(H.E染色)，其余置于85C冰箱保存，留作提取總RNA、GGT非編碼區(qū)基因擴(kuò)增以及GGT酶蛋白的制備。二、肝GGT酶蛋白提取與濃度分析稱取肝癌組織、癌旁和遠(yuǎn)癌組織濕重

11、50mg，以含0.5%Triton X-100的勻漿液置冰水浴中，高速勻漿后置于4C過(guò)夜，在高速冷凍離心機(jī)上，以15 000r/分離心45分鐘，留上清液于20C備用。以-谷氨酰對(duì)硝基苯胺直接法，分析上清液中GGT活力(U/L)，并以福林-酚試劑法測(cè)其蛋白濃度(g/L)，并計(jì)算出酶比活性單位(U/g)。三、肝組織總RNA制備與濃度精確稱取肝組織50mg，置于無(wú)RNAase勻漿器中，加入RNAzole 1.0ml勻漿2分鐘，再按Okamoto等5方法提取總RNA，加入TE緩沖液100l，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度計(jì)上測(cè)A260，換算出總RNA濃度(g/mg組織)。經(jīng)紫外分光掃描鑒定

12、，純化的RNA未受到污染和降解。其余RNA置于85C保存?zhèn)溆?。四、引物設(shè)置及逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR擴(kuò)增以肝癌細(xì)胞株GGT核苷酸序列5設(shè)計(jì)巢式PCR擴(kuò)增引物(1)，由中科院上海細(xì)胞所合成。設(shè)計(jì)擴(kuò)增序列位于GGT5-非編碼區(qū)，含有CCGG的M3位點(diǎn)(409bp處)。肝GGT-RNA先經(jīng)隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以此為模板在PE480型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，每次擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。第一階段PCR以外部引物(GT-1,5-CTCCATTCGTAGACCACCTC-3;GT-2,5-TAGGTTAGACTGTGGGCAGG-3)和cDNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物為400bp；第二階段PCR，以擴(kuò)增的P

13、CR產(chǎn)物為模板和內(nèi)部引物(GT-3，5-TGTCTGCCTCTGAGGTCAGA-3；GT-4，5-CAGGTCTCTTGCTCACTGTA-3)進(jìn)行擴(kuò)增，最終PCR產(chǎn)物280bp。作定性檢測(cè)并存于85C留作甲基化分析。1GGT部分基因及其擴(kuò)增位置示意五、GGT M3位點(diǎn)甲基化程度分析將GGT-RNA逆轉(zhuǎn)錄合成GGT-cDNA，再按上述第一階段PCR步驟擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取產(chǎn)物5l，加入Hap10U與雙倍體積Hap緩沖液混勻，37C作用4小時(shí)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在透射紫外光照射下，與標(biāo)準(zhǔn)DNA比較判別GGT的M3位點(diǎn)是否已甲基化。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后，若出現(xiàn)與原設(shè)計(jì)一致的322bp和78bp

14、片段，則表示GGT該段基因未甲基化；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后，被擴(kuò)增的基因片段仍表現(xiàn)為400bp，說(shuō)明限制性內(nèi)切酶Hap不能消化該位點(diǎn)，則表示GGT的基因已甲基化；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后無(wú)特異性DNA片段出現(xiàn)，則表示該段基因不能擴(kuò)增。結(jié)果一、肝癌組織的病理學(xué)檢查手術(shù)后的新鮮肝組織作病理檢查，按自身對(duì)照原則分三組：(1) 癌組：包括20例原發(fā)性肝癌(PHC)，4例系轉(zhuǎn)移性肝癌(來(lái)自胃癌2例，胰腺癌1例，乳腺癌1例)；(2)癌旁組：組織學(xué)顯示肝硬化17例，慢性肝炎3例，伴不典型增生16例；(3) 遠(yuǎn)癌組：肝硬化11例，慢性肝炎9例，伴不典型增生者11例；地衣紅染色示HBV陽(yáng)性者19例。二、肝總RNA濃度

15、與GGT比活性變化不同肝組織中總RNA濃度和總GGT比活性(T)變化，見(jiàn)表1。組織中總RNA濃度，肝癌組織明顯較癌周和遠(yuǎn)癌組織低(P0.05)，肝癌組織中總GGT比活性非常明顯地高于癌周和遠(yuǎn)癌組織(P0.01)。表1肝組織總RNA及T-GGT比活性變化(s)組別例數(shù)總RNA(U/mg)肝勻漿T-GGT(U/g)肝癌2421.1130.84100.6087.43癌周2439.9831.45*51.6121.71*遠(yuǎn)癌2453.8450.50*46.6116.42*與肝癌組織比較*P0.05*P0.05)，但各組內(nèi)未甲基化例與甲基化例的比較均差異有非常顯著性(P0.001)；各組中GGT基因未檢出

16、例，均系表1中RT-PCR未擴(kuò)增出特異性陽(yáng)性區(qū)帶的肝組織。表2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Hap酶切消化結(jié)果組織例數(shù)甲基化(%)未甲基化(%)未確定(%)肝癌246(25.00)17(70.83)*1(4.17)癌周247(29.17)14(58.33)*3(12.50)遠(yuǎn)癌246(25.00)13(54.17)*5(20.83)與甲基化例比較：*P0.001,*P0.025,*P0.05 討論肝組織癌變時(shí)能合成和分泌多種與肝癌相關(guān)的蛋白質(zhì)、多肽或同工酶，如AFP和GGT-等1，2，為了解肝癌GGT的產(chǎn)生與機(jī)制，本文研究了24例人肝癌癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織中GGT的表達(dá)與改變。經(jīng)病理學(xué)檢查，肝癌的

17、遠(yuǎn)癌組織以肝細(xì)胞變性為主，癌周組織以肝硬化為主，大多數(shù)組織(19例)伴有乙肝病毒感染，符合人類肝癌的多階段過(guò)程。肝癌組織總GGT比活性高于癌周及遠(yuǎn)癌組織(P0.05)，說(shuō)明GGT在肝癌、癌周組織呈過(guò)量表達(dá)趨勢(shì)。癌周及遠(yuǎn)癌組織GGT比活性比較差異無(wú)顯著性，系由于癌周和遠(yuǎn)癌組織多伴不同程度的肝炎、肝硬化，只是病變程度不同而已，未形成癌的質(zhì)的變化。肝癌的發(fā)生與DNA合成及核酸代謝旺盛密切相關(guān)6，7，但本組病例肝組織總RNA濃度，在各組間的差異有顯著性(P0.05)，且與GGT活性增加呈相反的變化，可能與人肝癌發(fā)生經(jīng)過(guò)不同程度肝炎、肝硬化到肝癌長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年的發(fā)病過(guò)程，其中包括肝細(xì)胞壞死、結(jié)節(jié)樣增生、假小

18、葉形成、大量的纖維結(jié)締組織代替正常肝細(xì)胞使腫瘤組織殘存肝細(xì)胞減少，同時(shí)伴腫瘤組織出血、壞死，則表現(xiàn)為有形細(xì)胞成分減少，組織總RNA減少，其復(fù)雜機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。GGT基因5-NC區(qū)由744個(gè)核苷酸組成(含6個(gè)CCGG位點(diǎn))，M3位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)如何尚不清楚。通過(guò)該項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)在M3位點(diǎn)存在廣泛的低甲基化，肝癌、癌周、遠(yuǎn)癌組織低甲基化頻率分別為70.83%、58.33%和54.17%，組間差異無(wú)顯著性，似乎與GGT活性有同向變化關(guān)系，提示GGT基因低甲基化誘導(dǎo)GGT表達(dá)，導(dǎo)致肝組織和血中GGT活性升高。Suzuki等8認(rèn)為，對(duì)LEC大鼠使用低甲基化5-雜氮胞嘧啶(5-aza)，使LEC大鼠5-

19、甲基胞嘧啶含量明顯的減少，同時(shí)鼠GGT大量表達(dá)，最終使該組大鼠發(fā)生肝腫瘤，而對(duì)照組未發(fā)生這種變化，說(shuō)明肝細(xì)胞對(duì)低甲基化藥物高度敏感，且DNA甲基化 減少在其發(fā)展為肝炎或肝腫瘤中起一定的作用。Baik等9以5-aza作用于高度甲基化的Fao細(xì)胞，在引起脫甲基化作用的同時(shí)，出現(xiàn)GGT強(qiáng)烈而穩(wěn)定的表達(dá)，認(rèn)為去甲基化增加GGT基因的表達(dá)。本組病例中，5例癌組織GGT基因M3位點(diǎn)發(fā)生甲基化，其中1例伴有癌旁組織M3位點(diǎn)甲基化，2例伴癌旁、遠(yuǎn)癌組織該位點(diǎn)甲基化，另2例(胃癌肝轉(zhuǎn)移1例)均不伴有癌旁、遠(yuǎn)癌組織該位點(diǎn)甲基化，提示肝癌時(shí)GGT基因甲基化類型存在著異質(zhì)性10。本研究?jī)H為初步認(rèn)識(shí)，但有關(guān)人類GGT基

20、因甲基化類型、GGT基因表達(dá)與GGT活性的關(guān)系，以及正常肝GGT的甲基化狀態(tài)等尚有待深入研究。國(guó)家教委留學(xué)回國(guó)人員課題(No.教外司留95)作者單位：224001江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院(湯琪云)；南通醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(姚登福、劉艷華、孟憲鏞、吳信華、吳瑋、陸建新)；鹽城市第二人民醫(yī)院(楊樹成)參考文獻(xiàn)1. 姚登福，孟憲鏞.肝癌特異性GGT診斷肝癌的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，1997，24：59-62.2. 姚登福，黃介飛，陳澍周，等.肝癌特異性GGT的發(fā)生及其定量分析的臨床價(jià)值.胃腸病學(xué)和肝臟病學(xué)雜志，1997，6：78-81.3. Choi EK, Uyeno S, Nishida N,

21、 et al. Alterations of c-fos gene methylation in the processes of aging and tumorigenesis in human liver. Mutation Res, 1996, 354:123-128.4. Peng SY, Lai PL, Chu JS, et al. Expression and hypomethylation of -fetoprotein gene in unicentric and multicentric human hepatocellular carcinomas. Hepatology,

22、 1993, 17:35-41.5. Okamoto T, Darbouy M, Broullet A, et al. Expression of the rat -glutamyl transferase gene from a specific promoter in the small intestine and in hepatoma cells. Biochemistry, 1994, 33:11536-11543.6. 湯其云，姚登福，劉艷華，等.鼠肝癌變過(guò)程中總RNA及不同分子形式GGT的表達(dá)與改變.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，18：139-141.7. Countay L, Heisterkamp N, Siest G, et al. E