大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展綜述

1、基因工程制藥綜述班級：生技132 姓名： 學(xué)號： 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展綜述自上世紀(jì) 70 年代以來, 大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。盡管基因工程表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴(kuò)大到酵母、昆蟲、植物及哺乳動物細(xì)胞,并且近年來出現(xiàn)了很多新型的真核表達(dá)系統(tǒng), 但是大腸桿菌仍然是基因表達(dá)的重要工具。 尤其是進(jìn)入后基因組時代以來, 有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展 ,對基因表達(dá)的要求更高,這時大腸桿菌往往是表達(dá)的第一選擇。文章綜述了近 年來有關(guān)大腸桿菌表達(dá)載體及宿主細(xì)胞的改造工作。1表達(dá)載體1. 1表達(dá)調(diào)控構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求, 同時也是影響基因表達(dá)水平以及蛋白活性的

2、重要因素。標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌表達(dá)載體的主要組成: 啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始區(qū)、多克隆位點(diǎn)、終止子、復(fù)制起點(diǎn)以及抗性篩選因子等。理想的表達(dá)載體要求在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上可以控制目的基因的表達(dá) ,然而目的基因在宿主體內(nèi)過分表達(dá)(選用較強(qiáng)的啟動子等)會對宿主造成壓力, 引起相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng), 影響蛋白的活性等?；蚪M、 RNA 轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝調(diào)控組等領(lǐng)域的研究成果給我們提供了大量關(guān)于基因表達(dá)調(diào)控的信息 1 。現(xiàn)已能從基因和細(xì)胞的整體水平來方便地選擇合適的啟動子或合 理開發(fā)新的載體系統(tǒng)。譬如 Lee 等利用二維凝膠電泳法比較了重組載體和空載體被分別轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后蛋白組學(xué)的差異,發(fā)現(xiàn)兩

3、者都產(chǎn)生了大腸桿菌熱休克蛋白并引起了 cAMPCRP 調(diào)節(jié)蛋白的應(yīng)答, 其中重組子的影響更為強(qiáng)烈；另外, 還發(fā)現(xiàn)外源基因的表達(dá)使宿主核糖體合成速率、翻譯延長因子和折疊酶表達(dá)水平、細(xì)胞生長率下降 , 而使細(xì)胞呼吸活力上升 2 。目前應(yīng)用的表達(dá)載體主要問題是 表達(dá)過程中出現(xiàn)的全或無的情況, 通常表達(dá)的培養(yǎng)物都是 非純種的細(xì)胞群, 其中有一些細(xì)胞可以最大限度地被誘導(dǎo),而另一些細(xì)胞在誘導(dǎo)后基因的表達(dá)被關(guān)閉。分離具有合適強(qiáng)度啟動子及翻譯速率的載體變種可以優(yōu)化表達(dá)水平,說明啟動子的選擇對于基因的誘導(dǎo)表達(dá)非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同強(qiáng)度級別啟動子的載體進(jìn)行互補(bǔ)分析, 可能有助于篩

4、選最為適合的啟動子3 。開發(fā)非 IPTG 或阿拉伯糖誘導(dǎo)的載體也可以提高基因表達(dá)水平, Qing 等利用 cspA 基因的獨(dú)特性開發(fā)了一系列冷休克表達(dá)載體 pCold, 使目的基因在低溫下(15) 誘導(dǎo)表達(dá),提高了產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性4 。 1. 2融合表達(dá)載體 除了表達(dá)載體的調(diào)控性,為了提高蛋白產(chǎn)物的活性以及簡化下游純化的操作等 ,往往在表達(dá)載體上插入其它輔助的基因序列與目的基因構(gòu)成融合蛋白表達(dá)。融合信號肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表達(dá)可以使融合蛋白通過經(jīng)典的 Sec 途徑分泌到周質(zhì)或胞外表達(dá), 有利于形成二硫鍵以及避免胞質(zhì)蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。 另外

5、,最近開發(fā)的雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系(Tat)可以有效分泌正確折疊的重組蛋白5 。常見的純化標(biāo)簽多根據(jù)親和層析的配體來選擇,如 6H is、GST 、CAT 、MBP 等經(jīng)過一步親和純化可以得到均一性較高的產(chǎn)物, 但化學(xué)洗脫會對產(chǎn)物的活性產(chǎn)生一定的影響。Ca2+依賴的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)和鏈球菌親和素結(jié)合肽(SBP)作為純化標(biāo)簽時, 只需要在洗脫液中移去標(biāo)簽依賴的離子或小分子就能實(shí)現(xiàn)溫和的特異性洗脫6 ,7 。再者, 應(yīng)用一些非層析的純化標(biāo)簽在純化操作中非常經(jīng)濟(jì)實(shí)用, 如熱敏型的類彈性蛋白多肽 (ELPs)可以使蛋白產(chǎn)物在溶解態(tài)和非溶解態(tài)之間轉(zhuǎn)變, 后續(xù)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)循環(huán)的純化方法可以達(dá)到親和純化的回收

6、率8 。另外,在純化標(biāo)簽與目的蛋白之間插入一些特殊的短肽,同時融合剪切酶可以在純化操作中利用標(biāo)簽的自剪切直接得到產(chǎn)物蛋白。 例如 SrtAc 酶所識別的短肽序列 GTEPL, 在蛋白 N 端依次連接短肽、剪切酶、6His 融合表達(dá),親和上柱后剪切酶發(fā)揮作用使 N 端帶有 Gly 的目的蛋白從融合狀態(tài)中釋放出來9 。噬菌體展示庫是表達(dá)抗體或其它蛋白庫的重要克隆技術(shù), 與之相似將目的基因同適 合的錨定序列融合可以使產(chǎn)物蛋白表達(dá)到大腸桿菌的表 面。大腸桿菌展示所用的融合配體一般為細(xì)菌的膜蛋白或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,如 PadL 是大腸桿菌長鏈脂肪酸的一種外 膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白,N 端融合 PadL 表達(dá)胞內(nèi)酶,以全

7、細(xì)胞的形式催化反應(yīng)表現(xiàn)出非常高的穩(wěn)定性10 ；Yang 等利用惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida 外膜酯酶 EstA 的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域作為表達(dá)胞內(nèi)-內(nèi)酰胺酶的錨定基序, 結(jié)果表明蛋白展示在細(xì)胞膜外并沒有影響細(xì)胞的活力11 。 1. 3共表達(dá)載體 很多真核基因表達(dá)的產(chǎn)物都必須以多聚復(fù)合體的形式組合才能表現(xiàn)出相應(yīng)的活性, 因此在表達(dá)這一類目的基因的時候常構(gòu)建共表達(dá)載體,另外共表達(dá)的策略在輔助新生蛋白質(zhì)的折疊和分泌中也很有意義。Dzinenu 等針對表達(dá)異源 二聚體構(gòu)建 了可以同 pET 載體 共表達(dá)的 載體 pOKD ,這種載體含有 p15A 復(fù)制起點(diǎn), 所以可以和大多數(shù)大腸桿菌表達(dá)載

8、體共存于細(xì)胞中12 。 細(xì)菌釋放素蛋白 (BRP)屬于細(xì)菌中的一類分泌蛋白, 共表達(dá)目的蛋白與 BRP 可以促進(jìn)產(chǎn)物直接釋放到培養(yǎng)基中13 。另外,共表達(dá) 分子伴侶也是促進(jìn)蛋白正確折疊的手段。目前對于分子伴侶構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)模式還處于探索階段, 研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中常見的分子伴侶 GroEL、H sp 同系物 DnaK 并非細(xì)胞內(nèi)所有蛋白折疊所必需的, 只有同核糖體結(jié)合的觸發(fā)因子協(xié)調(diào)作用才能促進(jìn)蛋白的適當(dāng)折疊13 。但是, 合理選擇個別的分子伴侶共表達(dá)可以避免產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)錯誤的折疊以及沉積。M arco 等設(shè)計(jì)了共表達(dá)分子伴侶的 3 載體系統(tǒng), 其中兩種載體分別攜帶不同的分子伴侶, 另外一種載體攜 帶

9、目的基因, 分子伴侶與目的基因被分別獨(dú)立誘導(dǎo)14 。 Cpn60 和 Cpn10 是從嗜冷菌中分離的一類分子伴侶, 共表達(dá)后可以使大腸桿菌在 4低溫下生長, 有利于蛋白的正確折疊15 。與分子伴侶類似, 共表達(dá) DsbA 或 Dsbc 等二硫鍵相關(guān)蛋白可以輔助形成正確的二硫鍵。 1. 4雙雜交系統(tǒng) 融合表達(dá)和共表達(dá)的另一個應(yīng)用是利用雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的相互作用。大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)也是有 3 種 載體構(gòu)成,誘餌蛋白融合表達(dá)載體、捕獲蛋白融合表達(dá)載 體和報(bào)告基因表達(dá)載體16 。以 AraC /LexA 雙雜交系統(tǒng)為 例,誘餌載體的啟動子選用 IPTG 誘導(dǎo)的 pT rc, 誘餌蛋白融合在轉(zhuǎn)錄激活

10、因子 ArcC 的 N 端表達(dá), 帶有卡那霉素的抗性基因; 捕獲載體的啟動子選擇非IPTG 誘導(dǎo)的 pTet,可以在去水四環(huán)素的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄, 捕獲蛋白融合在 LuxA 操縱子效應(yīng)物 LuxA 的 N 端, 帶有氨芐青霉素的抗性基因; 報(bào)告基因 LacZ 的啟動子選用大腸桿菌的 araBAD 啟動子, 其活性依賴于上游的 AraC 操縱子, 同時在啟動子下游安置 3 個定向重復(fù)的 LexA 操縱子半位點(diǎn), 載體帶有大觀霉素的抗性基因,另外在 AraC 上游插入 4 個串聯(lián)的 rrnB 終 止子,減小轉(zhuǎn)錄通讀對報(bào)告基因活性的背景影響。此 3 載 體共表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是誘餌蛋白同捕獲蛋白分別獨(dú)立誘導(dǎo),

11、可以通過控制誘導(dǎo)物的濃度逐步放大雜交蛋白相互作用對報(bào)告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。誘餌蛋白與捕獲蛋白分別結(jié)合在上游和下游的 2 個操縱子上, 如果二者可以發(fā)生雜交作用, 則在報(bào)告基因的 DNA 鏈上形成突環(huán), 使 AraC 轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn), 所以通過菌落的藍(lán)白斑差異可以篩選出發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。 1. 5Univector 系統(tǒng) 通常在構(gòu)建重組子表達(dá)時需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的作有, 進(jìn)行亞克隆, 而利用同源重組開發(fā)的載體可以實(shí)現(xiàn)基因的一次性克隆。Univector 表達(dá)系統(tǒng)(UPS) 就是這方面較為成功的實(shí)例16 。Univector 系統(tǒng)由兩類載體組成(圖 1): 一種稱為萬能的進(jìn)入載

12、體 pUN1, 具有特殊的 loxP 重組序列,通過重組酶 Cre 可以方便地穿梭進(jìn)入表達(dá)載體; 另一種即表達(dá)載體 pHOST , 同樣具有 loxP 序列, pHOST 是由不同的啟動子與融合標(biāo)簽組成的載體系列, 便于高通量篩選蛋白產(chǎn)物。 Univector 系統(tǒng)的特點(diǎn)是平行獨(dú)立克隆到多載體中, 使之在不同的誘導(dǎo)條件下表達(dá), 大大提高了表達(dá)的成功率, 尤其在蛋白組的研究中具有很大的應(yīng)用潛力3 。2宿主細(xì)胞在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因的主要優(yōu)勢: 一個是宿主的遺傳背景比較清楚, 易于控制基因的表達(dá); 另一個是大腸桿菌容易培養(yǎng), 可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。但是在商業(yè)應(yīng)用中很多的蛋白產(chǎn)物是真核基

13、因編碼, 并且具有高級的三、四級結(jié)構(gòu), 要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細(xì)胞的分子環(huán)境和折疊機(jī)制等與真核細(xì)胞具有很大的差異, 所以在應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)真核基因時有必要利用代謝工程或進(jìn)化的 方法改造細(xì)胞, 解決大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性, 提高產(chǎn)物的活性。 2. 1代謝工程載體攜帶目的基因進(jìn)入宿主表達(dá)會給宿主本身造成代謝上的負(fù)擔(dān), 影響細(xì)胞的生長速率等, 推測可能是因?yàn)樗拗鞑荒芴峁┳銐蛲庠椿虮磉_(dá)所需的原料及能量。減輕表達(dá)對于宿主的壓力可以通過控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)或者改變載體的抗性基因,還可以將目的基因直接插入染色體中表達(dá)。Flores 等則是將磷酸戊糖途徑的代謝關(guān)鍵酶6

14、磷酸葡萄糖脫氫酶的基因克隆到多拷貝質(zhì)粒中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌使細(xì)胞的生長速率在誘導(dǎo)后得到恢復(fù)17 。 除了利用大腸桿菌的代謝機(jī)制改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng) ,另外還可以人為地在大腸桿菌中設(shè)計(jì)代謝途徑, 例如 Masip 等設(shè)計(jì)的二硫鍵合成途徑。在大腸桿菌中催化二硫鍵形成的是周質(zhì)蛋白 DsbA ,此蛋白通過膜蛋白 DsbB 得到循環(huán)利用。 Masip 等選擇硫氧化還原蛋白 TrxA 作為二硫鍵的供體, 使之在氧化態(tài)的胞質(zhì)內(nèi)形成二硫鍵, 通過融合 Tat 特異性前導(dǎo)肽從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì),使重組蛋白在周質(zhì)獲得二硫鍵。因此這一途徑不依賴 DsbADsbS 體系,僅通過胞內(nèi)的硫氧化還原蛋白就能形成二硫鍵,所以可以修復(fù)缺失

15、 DsbADsbB 體系 的宿主18 。2. 2定向進(jìn)化 通常重組蛋白對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶都很敏感,為了避免蛋白酶的作用除了分泌表達(dá)外還可以對相關(guān)的蛋白酶進(jìn)行突變,例如篩選缺乏 ATP 依賴的胞內(nèi)蛋白酶的菌株, 但是對于是否細(xì)胞因此而上調(diào)其它的蛋白酶濃度還不清楚。另外在周質(zhì)中的蛋白酶也會降解產(chǎn)物蛋白, DegP 蛋白是存在于細(xì)胞周質(zhì)中的主要蛋白酶, 所以可以應(yīng)用 degP 失活的宿主表達(dá)蛋白。同時,C 端為非極性的蛋白應(yīng)該在 prc 突變的宿主中表達(dá)(Prc 蛋白酶作用于 C 端非極性的蛋 白), 或者以 N 端融合形式表達(dá)19 。前文已經(jīng)提到過選擇 分子伴侶的問題,利用定向進(jìn)化的方法分離分子伴

16、侶或折疊因子的變異體,可以針對重組蛋白進(jìn)行高效的特異性折 疊。Weissman 等對大腸桿菌進(jìn)行多輪的 DNA 改組和篩選,分離出的 GroEL 突變體提高了對綠色熒光蛋白的折疊效率20 。另外,定向進(jìn)化的方法還可以擴(kuò)大大腸桿菌的遺傳密碼,在蛋白中添加非天然的氨基酸。決定氨酰 tRNA 合酶催化 tRNA 攜帶正確氨基酸的因素是不同于氨酰化位點(diǎn)的一個編輯位點(diǎn)。通過對染色體的隨機(jī)誘變,篩選出一類突變體可以催化 tRNAVal 結(jié)合Ser,并且20%細(xì)胞內(nèi)的 Val都被類似于 Ser 的氨基丁酸取代21 。 Schultz 等向大腸桿菌中引入一對特殊的 tRNA /氨酰 tRNA 合酶, 摻入對琥

17、珀密碼子應(yīng)答的甲基化酪氨酸, 在表達(dá)二氫葉酸還原酶的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),由于非天然氨基酸的存在使基因翻譯的保真度達(dá)到99%22 。 2. 3蛋白質(zhì)的糖基化很長時間以來 , 大腸桿菌被認(rèn)為不能表達(dá)糖基化蛋白,因?yàn)樵思?xì)胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核細(xì)胞中,大多數(shù)分泌蛋白都在翻譯后加工過程中獲得 N 端的寡糖鏈。寡糖(Glc3Man9GlcAc2)被類脂運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白的 N 端, 由寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶催化寡糖與天冬酰氨或絲氨酸/蘇氨酸殘基形成 N 連接或 O 連接?？漳c彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有類似真核糖基化代謝功能的原核生物, 其基因組中的 pgl 基因簇編碼的蛋

18、白類似于真核細(xì)胞中的糖基轉(zhuǎn)移酶。Wacker 等將空腸彎曲桿菌的糖基化基因克隆到大腸桿菌中表達(dá),結(jié)果 pgl 編碼的蛋白 PglB 可以指導(dǎo)質(zhì)粒編碼的 AcrA 蛋白的糖基化。 通過對表達(dá)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn), 大腸桿菌與真核細(xì)胞表達(dá)的 糖蛋白在寡糖鏈組成上沒有相似性, 但是同樣與 AsnXaaSer /Thr 的氨基酸殘基結(jié)合23 。Schultz 等將進(jìn)化突變的方法應(yīng)用于蛋白的翻譯后加工中, 結(jié)果獲得了高產(chǎn)率的糖基化的肌紅蛋白。他們從甲烷球菌中分離出酪氨酸 tRNA 合酶 TyrRSs基因,在活性位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變, 經(jīng)過幾輪陽性和陰性篩選后得到對-乙酰氨基葡萄糖-絲氨酸具有特異性的 TyrRSs

19、。這種氨酰 tRNA 合酶可以對琥珀密碼子 TAG 應(yīng)答催化形成 tRNATyrGlcNAc 對; GlcNAc 的摻入為蛋白的糖基化提供了初級的糖基化位點(diǎn), 可以被糖基轉(zhuǎn)運(yùn)酶識別進(jìn)一步合成復(fù)雜的糖鏈。這種方法也可以應(yīng)用于其它的翻譯后加工中 ,包括蛋白的甲基化、磷酸化、乙酰化等24 。 基因的表達(dá)過程是一個復(fù)雜的過程, 涉及基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工、細(xì)胞的代謝以及細(xì)胞內(nèi)基因與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。 進(jìn)入后基因時代之后, 大腸桿菌首先被選作研究蛋白組學(xué)、基因功能、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)等新課題的模型, 揭示了很多基因表達(dá)的未知領(lǐng)域, 同 時提供了更多發(fā)展大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的依據(jù)。伴隨分子生物學(xué)新

20、技術(shù)的涌現(xiàn),大腸桿菌勢必在實(shí)驗(yàn)研究及工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的應(yīng)用中發(fā)揮出更大的作用。參考文獻(xiàn)1 Reed J L, Palsson B. T hirteen Years of Building ConstraintBased In Silico Models of Escherichia coli J . Journal of Bacteriology , 2003,185(9):2692.2 Lee P S, Lee K H. Escherichia ColiA Model System That Benefits From and Contributes to the Evolution of

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