乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體的制備及其初步鑒定

1、乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體的制備及其初步鑒定         11-01-30 15:49:00     作者：張小艷    編輯：studa20【摘要】  目的: 研制抗乙肝病毒G145R變異表面抗原的單克隆抗體(mAb)。方法: 將重組乙肝病毒G145R變異表面抗原以Al(OH)3佐劑化, 常規(guī)免疫BALB/c小鼠, 采用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗乙肝病毒G145R變異表面抗原的mAb。采用ELISA對(duì)制備物的效價(jià)與

2、特異性進(jìn)行鑒定, 將其用于部分臨床標(biāo)本的檢測(cè), 并與德國(guó)抗HBs mAb GL2.001進(jìn)行比較。結(jié)果: 獲得1株穩(wěn)定分泌抗G145R HBs mAb的雜交瘤細(xì)胞, 命名為4E12。該細(xì)胞株染色體數(shù)目為90條, 所分泌mAb屬IgG1亞類。其培養(yǎng)上清與腹水抗G145R HBs ELISA效價(jià)為(0.51)×103及(110)×106。經(jīng)持續(xù)3月培養(yǎng), 低血清適應(yīng)以及反復(fù)凍存與復(fù)蘇后, 其細(xì)胞增殖能力與上清抗G145R HBs效價(jià)與克隆化結(jié)束時(shí)大致相似。將其與德國(guó)抗G145R HBs mAb GL2.001相比, 二者對(duì)重組乙肝表面抗原G145R變異S蛋白的反應(yīng)性大致相當(dāng),

3、靈敏度前者稍低于后者（分別為2.0 g/L與1.0 g/L）。對(duì)野生株表面抗原的檢測(cè)前者在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未顯示有意義的反應(yīng)信號(hào), 后者在與高濃度（1 mg/L及以上）抗原反應(yīng)時(shí)S/N值達(dá)到或高于3.9。將二者用于對(duì)一組特定患者的臨床檢測(cè), 其陽(yáng)性率前者（17/200, 8.5%）較后者（11.5%）略低, 其差別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論: 成功地制備了1株抗乙肝表面抗原G145R變異體的mAb, 為乙肝G145R變異的基礎(chǔ)、 臨床與流行病學(xué)研究提供了進(jìn)一步的物質(zhì)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  乙型肝炎病毒 免疫逃逸變異 HBsAg G145R變異 單克隆抗體新近資料

4、顯示,   不同試劑對(duì)G145R變異HBsAg（mtHBsAg G145R）的檢測(cè)能力僅為對(duì)野毒型HBsAg檢測(cè) 的50 %或更低1,   這給HBV感染的免疫學(xué)診斷、 血源篩選和乙肝疫苗的研制提出了新的問(wèn)題。為深入開(kāi)展乙肝病毒免疫逃逸變異的臨床與流行病學(xué)研究,   我們?cè)诩韧ぷ鞯幕A(chǔ)上采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行抗乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體（抗G145R HBs mAb)的研究。1  材料和方法1.1  材料  RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司; BALB/c小鼠由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)

5、物室提供; Al(OH)3凝膠和重組野生HBsAg（wtHBsAg,   CHO細(xì)胞表達(dá),   純化疫苗前體）等由中國(guó)生物制品總公司武漢生物制品研究所提供; Sp2/0細(xì)胞由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供; PEG4000、 HAT與HT、 以及小鼠免疫球蛋白亞類檢測(cè)試劑等均購(gòu)自Sigma公司; 山羊抗小鼠IgG及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Pierce公司; HRP標(biāo)記山羊抗HBs多克隆抗體,   純化mtHBsAg G145R、 mtHBsAg G145RELISA質(zhì)控參照品及其抗HBs G6 mAb（下稱G6 mAb）等由

6、本室制備2,   5。衛(wèi)生部國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）頒定之HBsAg ELISA質(zhì)控血清由湖北省臨床檢驗(yàn)中心提供?？笹145R HBs GL2.001.2 mAb由德國(guó)ESSEN大學(xué)病毒研究所陸蒙吉教授惠贈(zèng)（下稱 GL2.001 mAb,  該抗體能與mtHBsAg G145R結(jié)合）3。2A8細(xì)胞系（分泌mtHBsAg G145R）由本院臨床免疫研究室提供4。    受檢血清200份(年齡2056歲)自本院檢驗(yàn)科和感染病病原實(shí)驗(yàn)室采集,   類型為:  （1）臨床報(bào)告HBsAg呈陰性, &#

7、160; 但有一項(xiàng)或幾項(xiàng)除HBsAb以外的HBV標(biāo)志物呈陽(yáng)性; （2）HBsAg、 HBsAb雙陽(yáng)性。正常對(duì)照血清40份,   均有成功的乙肝疫苗接種史,   抗HBs陽(yáng)性,   其他HBV標(biāo)志陰性,   且生化指標(biāo)及其他肝炎病毒標(biāo)志均正常。 1.2  方法1.2.1  雜交瘤細(xì)胞株的建立  （1）小鼠免疫:初次免疫用純化的 mtHBsAg G145R（5 g/只）與Al(OH)3混合置4過(guò)夜,   經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。2周后,  用相同

8、劑量的抗原及相同的方法進(jìn)行2次免疫。于細(xì)胞融合前3 d,   再用同等劑量的抗原(未佐劑化)腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。（2）細(xì)胞融合:  按本室以往報(bào)道方法進(jìn)行6。（3）雜交瘤細(xì)胞的篩選:  采用ELISA A及ELISA B分兩步進(jìn)行,   用于篩選A法強(qiáng)陽(yáng)性而B(niǎo)法陰性的雜交瘤細(xì)胞克隆。ELISA A: 先用山羊抗小鼠IgG包被（包被濃度2.5 mg/L）,   4過(guò)夜。次晨洗板5次,   每次1 min,   再以10 g/L的BSA封閉,   37放置2

9、 h后,   加入待篩選的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,   37反應(yīng)45 min,   洗板后依次與2A8細(xì)胞培養(yǎng)上清及HRP標(biāo)記的山羊抗HBs多克隆抗體反應(yīng),   反應(yīng)條件同上,   洗板后加TMBH2O2顯色15 min,   以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)并測(cè)定A450值。ELISA B:  以wtHBsAg包被（10 mg/L）,   4過(guò)夜。洗板、 封閉同前。然后依次加入第一步篩選陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,&#

10、160;  同前反應(yīng)（37反應(yīng)45 min）,   洗板后顯色并測(cè)定A450值,   以S/N2.1判為陽(yáng)性。（4）克隆化:  共3次,   采用有限稀釋法。1.2.2  腹水制備與檢測(cè)  腹水制備采用降植烷腹腔誘導(dǎo)法。腹水蛋白含量檢測(cè)采用紫外比色法,   以BSA為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其總蛋白含量。1.2.3  雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定  采用秋水仙素分裂阻斷法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定。1.2.4  抗體效價(jià)測(cè)定  采用ELISA A篩選法進(jìn)行。以P

11、/N最接近2.1的反應(yīng)孔所加待測(cè)標(biāo)本稀釋度的倒數(shù)作為所測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清（或腹水）的效價(jià)。1.2.5  小鼠mAb Ig亞類鑒定  采用膠體金免疫層析試紙條法,  按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。1.2.6  抗體的純化  腹水mAb經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀7后,   再以Protein A親和層析法進(jìn)行純化,  操作按試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2.7  4E12ELISA方法的建立  采用純化的4E12 mAb包被,   HRP標(biāo)記的山羊抗HBs多抗示蹤建立雙抗體夾心ELISA方法。并采用棋盤(pán)滴定實(shí)

12、驗(yàn)對(duì)包被抗體和示蹤抗體進(jìn)行檢定。1.2.8  敏感性判定  將該方法用于檢測(cè)各個(gè)濃度的G145R變異重組HBsAg ELISA質(zhì)控參照品,   判定其檢測(cè)下限。并同時(shí)用GL2.001 mAb 進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。1.2.9  特異性判定  （1）抗原取代實(shí)驗(yàn):  以4E12 mAb和GL2.001 mAb平行包被酶標(biāo)板,   分別加入2A8細(xì)胞培養(yǎng)上清,   濃度為5 mg/L、 1 mg/L、 100 g/L、 10 g/L、 1 g/L的wtHBsAg,   NCCL

13、頒定HBsAg ELISA質(zhì)控血清（10 g/L）,  狂犬疫苗,   腺病毒,   最后以HRP標(biāo)記的山羊抗HBs示蹤,   加TMD底物顯色后觀察結(jié)果。（2）抗體中和實(shí)驗(yàn):  以GL2.001 mAb包被酶標(biāo)板,   將4E12 mAb腹水系列稀釋成1×1011×106,  與等體積2A8上清混合,   37溫育45 min,   將混合物分別加至包被板各相應(yīng)孔中,   每孔100 L, &#

14、160; 同上溫育45 min后,   依次加入HRP標(biāo)記的山羊抗HBs及TMD等做GL2.001ELISA,   并根據(jù)未中和孔計(jì)算各孔中和率。計(jì)算公式為:  阻斷率=（阻斷孔光密度值-陰性對(duì)照孔光密度值）/(非阻斷孔光密度值-陰性對(duì)照孔光密度值)×100。1.2.10  GL2.001ELISA  其方法與4E12EL ISA同,   包被改用GL2.001 mAb,  具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道2。1.2.11  G6 ELISA  用于上述兩法陽(yáng)性標(biāo)本的復(fù)核,   其操作見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道6。2  結(jié)果2.1  雜交瘤細(xì)胞的建立  常規(guī)融合、 篩選及克隆化后,  獲得1株可分泌高效價(jià)mAb的雜交瘤細(xì)胞,  命名為4E12 mAb。將此株雜交瘤細(xì)胞體外連續(xù)傳代20代并培養(yǎng)3個(gè)月以上,  反復(fù)凍存復(fù)蘇4次后,  其培養(yǎng)上清抗G145R HBs ELISA效價(jià)保持在(0.51)×103范圍。2.2  腹水制備及檢測(cè)  采用降植烷腹腔誘導(dǎo)法誘生4E12 mAb腹水,