雜質(zhì)檢查方法的方法學(xué)驗證各項指標(biāo)分析

1、雜質(zhì)檢查方法的方法學(xué)驗證各項指標(biāo)分析學(xué)號：20120262 姓名：王芳藥物分析中藥品檢驗基本程序包括：鑒別、檢查、含量測定、寫實驗報告等步驟。檢查項下包括反映藥品安全性有效性的試驗方法和限度、均一性、純度等制備工藝要求等內(nèi)容。藥物的雜質(zhì)是指藥物中存在的無治療作用或者影響藥物的穩(wěn)定性、療效,甚至對人體的健康有害的物質(zhì)。雜質(zhì)的來源可由生產(chǎn)和貯藏過程中引入：生產(chǎn)過程中主要是由于所用原料不純或者原料反應(yīng)過程中反應(yīng)未完全,以及反應(yīng)的中間產(chǎn)物、 反應(yīng)的副產(chǎn)物等造成藥品原料中雜質(zhì)的存在；或者是由原料生產(chǎn)過程中反應(yīng)的溶媒、催化劑等溶劑的殘留所造成的藥物的雜質(zhì)。貯藏過程引入主要是受溫度、 濕度、 日光、 空氣等

2、外界條件的影響或者受微生物的作用產(chǎn)生的雜質(zhì)1。在藥物的研究、 生產(chǎn)、 貯存和臨床應(yīng)用等方面, 必須保持藥物的純度, 降低藥物的雜質(zhì),這樣才能保證藥物的有效性和安全性2。原料藥和制劑主要是對藥物中的微量雜質(zhì)進行純度檢查，以判斷藥物純度是否符合雜質(zhì)限量的規(guī)定要求，而生物制品的雜質(zhì)檢查除包括一般雜質(zhì)檢查，特殊雜質(zhì)檢查外還應(yīng)對其進行安全性檢查。雜質(zhì)定量、定性檢查方法主要是根據(jù)藥物和特殊雜質(zhì)在理化性質(zhì)上的差異來進行的，可以采用容量分析法，光譜法分析法，色譜分析法等3，各種檢測方法所需的方法學(xué)驗證的指標(biāo)包括準(zhǔn)確度，精密度，專屬性，線性，范圍，檢測線、定量線，耐用性八項指標(biāo)，但采用不同方法所需的指標(biāo)不盡相同

3、，雜質(zhì)限量檢查一般需要驗證專屬性，檢測線，耐用性。而雜質(zhì)定量分析方法除檢測限外其它指標(biāo)一般都需驗證4。不同實驗應(yīng)該根據(jù)不同實驗?zāi)康膶Ω黜椫笜?biāo)進行驗證，下面就雜質(zhì)種類及近年來檢測雜質(zhì)最常用的檢測方法進行分析：1、 特殊雜質(zhì)特殊雜質(zhì)是指在藥物制備和貯存過程中, 由于藥物性質(zhì)不穩(wěn)定而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物, 或合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物等, 多指有機雜質(zhì), 也包括殘留溶劑和手性化合物中無特殊毒性的對映體5。1.1 HPLC 法測定萘普生緩釋片有關(guān)物質(zhì)的含量6：該緩釋片主藥是萘普生，特殊雜質(zhì)為（6甲氧基2萘乙酮，方法采用高效液相色譜法(HPLC 法; 色譜柱: 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑; 以0.05mol

4、 /L 的磷酸二氫鉀甲醇-乙腈( 40: 25: 35 磷酸調(diào)節(jié)PH至3.0為流動相; 檢測波長為240nm; 流速:1.0ml /min; 進樣量: 10l .首先針對高效液相色譜法應(yīng)進行系統(tǒng)適應(yīng)性指標(biāo)（理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性、拖尾因子）驗證，該實驗得出萘普生主峰與已知雜質(zhì)峰( 6-甲氧基-2-萘乙酮 分離良好，萘普生主峰理論半數(shù)大于5000，符合規(guī)定。精密度考察:精密度考察主要有三個層次包括日內(nèi)精密度，日間精密度以及重現(xiàn)性考察，一般受條件限制只進行前兩者的指標(biāo)驗證。本實驗針對色譜條件對樣品對照品及雜質(zhì)對照品進行檢測是對日內(nèi)精密度的一個考察，也可以看成是對高效液相法色譜條件系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

5、的一個指標(biāo)驗證。取萘普生對照品和已知雜質(zhì)對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每 1ml 約含萘普生0.25mg 和已知雜質(zhì)0.25g 的混合對照品，取上述混合對照品溶液10l， 注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果萘普生與已知雜質(zhì)主峰面積的 RSD 分別為0.12%和0.17%， 說明該色譜條件精密度良好。重復(fù)性考察:如上同樣是對日內(nèi)精密度進行指標(biāo)驗證，但是此處重復(fù)性考察是對包括已知雜質(zhì)在內(nèi)的所有雜質(zhì)以及主藥進行的一個方法學(xué)指標(biāo)驗證。取地奧集團成都制藥有限公司的萘普生緩釋片細粉( 約相當(dāng)于含萘普生25mg 6份及已知雜質(zhì)對照品適量，配制供試品溶液和對照溶液，精密量取供試品溶液和對照溶

6、液各10l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，已知雜質(zhì)按雜質(zhì)對照品法計算含量，其他雜質(zhì)以萘普生主成分自身對照法計算含量，由試驗結(jié)果表明，6份供試品溶液中總雜質(zhì)的平均值為 0.365%，RSD為0.93%，最大雜質(zhì)的平均值為 0.057%，RSD為2.41%，同時未檢出已知雜質(zhì)，說明擬定的色譜條件重復(fù)性好。輔料干擾試驗: 取供試品溶液和空白輔料溶液各 10l， 分別注入液相色譜儀，試驗結(jié)果顯示輔料不干擾樣的有關(guān)物質(zhì)檢查。破壞性試驗:分別用酸、堿、氧化、高溫、光照條件對供試品進行破壞性試驗。由試驗結(jié)果得，供試品經(jīng)破壞后， 主峰與各雜質(zhì)峰之間， 已知雜質(zhì)與其他雜質(zhì)峰之間分離度均大于1.5， 說明該方法

7、專屬性較好。專屬性試驗主要是S/N=3時的最低濃度或量，主要用來驗證該方法的靈敏度。該實驗分別對萘普生對照品及已知雜質(zhì)對照品進行方法指標(biāo)驗證:耐用性考察是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，一般包括對溶液的穩(wěn)定性，樣品提取時間、次數(shù)以及儀器型號和條件（流動相組成，比例，柱溫，流速等）的改變進行考察，該實驗是對溶液的穩(wěn)定性來實現(xiàn)：取同批號的萘普生緩釋片細粉( 約相當(dāng)于含萘普生25mg 及已知雜質(zhì)對照品適量， 精密稱定，配制供試品溶液和對照溶液， 精密量取供試品溶液和對照溶液各 10l， 在 0 、2、4、8小時， 分別注入液相色譜儀， 記錄色譜圖， 結(jié)果供試品溶液放置8h， 其

8、最大雜質(zhì)含量的 RSD 為2.28%，總雜質(zhì)含量的 RSD 為1.58%， 同時未檢出已知雜質(zhì)，表明供試品溶液在8小時內(nèi)基本穩(wěn)定。藥典對萘普生樣品對照品及已知雜質(zhì)對照品的含量測定方法均有記載，然而該實驗無需載進行線性和范圍及定量限的方法學(xué)驗證。但是該實驗未對準(zhǔn)確度考察是方法學(xué)指標(biāo)驗證的不完整性。1.2 苯磺酸左旋氨氯地平片中右旋雜質(zhì)的檢查7:該實驗驗證專屬性，標(biāo)準(zhǔn)曲線、范圍、檢測限及定量限，穩(wěn)定性實驗（耐用性），精密度與重復(fù)性實驗，回收率實驗八項指標(biāo)，雖然在未在指標(biāo)驗證中做系統(tǒng)適應(yīng)性實驗，但在討論中提到最佳檢測波長，最佳色譜條件專屬性試驗：分別以空白輔料C :20L,左旋體B: 20L，含1%

9、右旋體 A :20L，注入色譜儀，由AB得左旋體保留時間38.6min, 右旋異構(gòu)體43.4min,兩色譜峰的分離度符合要求;表明在右旋體保留時間處無雜峰, 說明對測定無干擾。見圖1。 圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線、范圍、定量限、檢測線：取6個不同濃度梯度左旋標(biāo)準(zhǔn)品測A值，以A橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)得線性回歸，r=0.9996，說明線性好。線性與范圍相輔相成，以此得范圍1.0-2.0g/mL。同時在此條件下S/N=3時檢測線為5ng，S/N=10時檢測線為15ng。1.23穩(wěn)定性實驗：由于操作從溶液配置到檢測需要較長時間，且藥物中含其他雜質(zhì)，藥物也可能隨時間降解，因而需進行穩(wěn)定性驗證。對配置好標(biāo)準(zhǔn)混合液，在8小

10、時內(nèi)每2小時測定一次，得右旋RSD=1.6%,左旋RSD=2.9%精密度、重復(fù)性：高效液相法測定左旋、右旋結(jié)構(gòu)需要對其精密度考察。同樣也要對有輔料及雜質(zhì)存在的片劑粉末進行重復(fù)性指標(biāo)驗證?；厥章剩汉繙y定回收率實驗必不可少，證明該方法的準(zhǔn)確度。在粉末中定量加入右旋雜質(zhì)3個濃度，分別檢測3次，檢測平均回收率99.3%。RSD=1.9%。說明該實驗準(zhǔn)確度好。1.3 高效毛細管電泳法用于環(huán)丙沙星原料藥的雜質(zhì)限量分析8：雜質(zhì)限量分析指標(biāo)驗證了線性、范圍、檢測限、精密度指標(biāo)，而由分析條件得雜質(zhì)與環(huán)丙沙星的出峰時間無干擾，專屬性強；離子對 HPLC法測定鹽酸倍他司汀注射中藥物與有關(guān)物質(zhì)含量9八項指標(biāo)全都驗證

11、；丙泊酚甲磷酸鈉鹽的含量測定及其雜質(zhì)檢查10:該實驗是對藥丙泊酚甲磷酸鈉的丙泊酚雜質(zhì)進行檢查，采用高效液相法,除準(zhǔn)確度其他指標(biāo)均驗證。1.4針對不同實驗?zāi)康?，對藥典中已記載的檢測方法進行優(yōu)化時，可以不對八項指標(biāo)在此驗證:辛伐他汀原料中雜質(zhì)檢查方法探討11,采用自制TLC板與進口板參照美國藥典對辛伐他汀原料藥中雜質(zhì)檢查，無需在對方法各項指標(biāo)一一驗證，但是需對最低檢測線進行考察以確定方法的可靠性及可用性。毗呱酸雜質(zhì)檢查方法的研究12，該實驗主要是對雜質(zhì)種類的考察，因板吸附劑的活性或含水量影響分離，雜質(zhì)的Rf值決定分離度，最小檢測線決定雜質(zhì)能被檢出的最小量，不需要對雜質(zhì)定量測定，所以只需對其進行耐用

12、性，最小檢測線，分離度進行驗證。單硝酸異山梨酯緩釋膠囊（）中異山梨醇的薄層色譜雜質(zhì)檢查13:該實驗?zāi)康氖菍δz囊中異山梨醇的雜質(zhì)限量，供試品中的雜質(zhì)斑點顏色不得深于雜質(zhì)對照品主斑點。雜質(zhì)斑點與其他斑點不重合，無拖尾，專屬性強；能定性檢測的最低檢測限指標(biāo)需驗證，通過對照品進行多次考察，確定可檢查的檢測限濃度；重復(fù)多次試驗驗證方法重現(xiàn)性好。1.5 對于雜質(zhì)檢查方法的選擇比較中對八項指標(biāo)得驗證要求也較為嚴格：甲芬那酸中2, 3 -二甲基苯胺雜質(zhì)限量控制方法的研究14，比較了比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法測定甲芬那酸中2, 3 -二甲基苯胺雜質(zhì)的方法各項指標(biāo)，主要包括更換儀器的耐用性，回收率測定的準(zhǔn)

13、確度試驗，精密度實驗，最低檢測性，專屬性試驗等，線性、范圍的比較意義不大因而無需進一步驗證1.6 物理法檢查是利用藥物與雜質(zhì)性狀上的差異，一般采用的方法是建立在專屬性之上，無需專屬性試驗。如蒲黃雜質(zhì)檢查方法的研究15采用顯微鏡法檢查蒲黃中雜質(zhì)量，僅需記錄顯微視野中雜質(zhì)的個數(shù),不存在含量測定中的線性等指標(biāo)2.一般雜質(zhì)檢查一般雜質(zhì)自然界中分布廣泛，在多種藥物的生產(chǎn)貯藏過程中易引入，中國藥典附錄中規(guī)定氯化物、硫酸鹽、硫化物、重金屬鹽、酸堿度、澄清度、有機殘留等項目的檢查方法16。一般雜質(zhì)考察的方法大多參考中國藥典的記載，方法學(xué)指標(biāo)驗證一般較少,很多都不進行指標(biāo)驗證17-參考文獻：1 許潤娟. 藥物的

14、雜質(zhì)及雜質(zhì)檢查J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（7）：1323-13252 宋麗,臧志和,廖洪利,謝靜,曹麗萍,王靜. 藥物中有關(guān)物質(zhì)檢查方法研究進展J. 西南國防醫(yī)藥,2007 ,17 (6:809-8114 杭太俊.藥物分析，第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，20115 宋麗, 臧志和, 廖洪利, 謝靜. 藥物中特殊雜質(zhì)檢查方法的研究進展及評價J. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007 ,2(3-4 6 吳丹,王玉和,王全洪,向志祥. HPLC 法測定萘普生緩釋片有關(guān)物質(zhì)的含量J. 醫(yī)學(xué)信息,2011,6:2688-26907 胡政華,陳靜. 苯磺酸左旋氨氯地平片中右旋雜質(zhì)的檢查J.西北藥學(xué)雜志, 2011

15、, 26(2:98-1008 尹茶,吳玉田. 高效毛細管電泳法用于環(huán)丙沙星原料藥的雜質(zhì)限量分析J. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,21(10:950-9519 陸榕,孫進,方金玲,孫英華,劉曉紅,何仲貴.離子對 HPLC法測定鹽酸倍他司汀注射中藥物與有關(guān)物質(zhì)含量J.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(7:448-45110 程妍,劉三康,付春梅,李章萬.丙泊酚甲磷酸鈉鹽的含量測定及其雜質(zhì)檢查J. 華西藥學(xué)雜志,2007 , 22( 1: 074-07611 菅凌燕,楊麗,鄭力,劉秀蘭. 辛伐他汀原料中雜質(zhì)檢查方法探討J. 遼寧藥物與臨床, 2000, 3 (212 李靜,李冰,谷彥杰 .毗呱酸雜質(zhì)檢查方法的研究J.山東醫(yī)藥工業(yè),2000,19(6:213 黃雷,李壯,閔奇,張春宏.單硝酸異山梨酯緩釋膠囊（）中異山梨醇的薄層色譜雜質(zhì)檢查J.中國醫(yī)藥指南,2011,