微囊化轉(zhuǎn)TH基因人成纖維細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病大鼠模型的研究

1、    微囊化轉(zhuǎn)TH基因人成纖維細(xì)胞腦內(nèi)移植 治療帕金森病大鼠模型的研究        【摘要】目的探討微囊化轉(zhuǎn)酪氨酸羥化酶(TH)基因的細(xì)胞在帕金森病(PD)大鼠模型腦內(nèi)存活、組織反應(yīng)及對異常行為的治療效果。方法以人TH基因作為目的基因，重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染人成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞包裹在APA半透膜中進行微囊化后，植入6-羥多巴胺單側(cè)損毀的PD大鼠模型紋狀體內(nèi)，觀察移植物的存活狀況和功能作用16周。結(jié)果體外和植入體內(nèi)的微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有良好的存活能力。移植微囊化

2、細(xì)胞可以使大鼠異常運動明顯改善，移植位點周圍的免疫反應(yīng)較小。結(jié)論微囊化對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞異種移植以進行基因治療具有顯著意義?！娟P(guān)鍵詞】帕金森??；基因治療；酪氨酸羥化酶；人成纖維細(xì)胞；微囊；大鼠【中分類號】R74.25【文獻標(biāo)識碼】A【文章編號】0529-1356(2000)04-317 AN EXPERIMENTAL STUDY ON GENE THERAPY WITHINTRACEREBRAL TRANSPLANTATION OF MICROCAPSULATEDHUMAN FIBROBLASTS EXPRESSING TH GENEIN RAT MODEL OF PARKINSON DISEASE

3、DAI Xiao-lingZHANG Jin-luXU Qun-yuanZHAO Chun-liZHAO Huan-yingSUN Xiao-hongZHENG Shao-peng（Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China）【Abstract】ObjectivesThe aim of this study was to evaluate the survival of the grafts, their immune response fro

4、m hostissue and improvement of the locomotion after the intracerebral transplantation of microcapsulated genetically modified cells in the rat model of Parkinson Disease(PD). MethodsThe human tyrosine hydroxylase(TH) gene was recombined into a retrovirus vector and the newly constructed vector was t

5、hen transfected into primary cultured human fibroblasts in vitro.These human fibroblasts were microcapsulated by the alginate-polylysine-alginate(APA)semipermeable membrane. The rat model of PD was made by unilateral 6-OHDA injection in the midbrain. These microcapulated genetically modified human f

6、ibroblasts were transplanted into the brain of the rat models. ResultsThe microcapsulated cells could survive well in vivo at least 16 weeks. The grafting of these cells could induce a marked decrease in abnormal locomotion for the animal models and make a less immunorejection from host tissue. Conc

7、lusionThe APA-microcapsulation may help gene therapy by use of xenograft with genetically modified cells.【Key words】Parkinson disease; Gene therapy; Tyrosine hydroxylase; Human fibroblast; Microcapsule; Rat帕金森病(Parkinson Disease, PD)的主要病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元變性，使紋狀體內(nèi)的DA顯著減少而出現(xiàn)一系列臨床癥狀。將分泌多巴胺的胚

8、胎中腦細(xì)胞或腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞進行紋狀體內(nèi)移植，能一定程度地逆轉(zhuǎn)或改善患者的癥狀。此外，新近發(fā)展起來的基因治療方法，即利用各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源性基因如DA合成限速酶-酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因轉(zhuǎn)入某種體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，再將此基因工程細(xì)胞植入模型動物腦內(nèi)，使之在紋狀體表達TH1，2，而達到提高DA水平的目的。但是，大量研究證明，無論用哪種細(xì)胞植入腦內(nèi)都存在宿主免疫排斥的問題，在進行同種異體基因和異種基因細(xì)胞移植中尤為顯著3?，F(xiàn)有報道，將丙烯共聚物微囊植入大鼠腦內(nèi)誘導(dǎo)的宿主組織反應(yīng)較小。這種通過分子量界值為50 000道爾頓的微囊半透膜容許營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和

9、神經(jīng)遞質(zhì)等小分子自由擴散，但能阻止大分子的免疫球蛋白和宿主細(xì)胞跨過微囊膜攻擊移植細(xì)胞，從而對移植物提供免疫隔離4，故用微囊包裹的細(xì)胞移植勢必大大減少宿主的免疫排斥并提高移植物的存活率。據(jù)此，本研究擬對轉(zhuǎn)TH基因的人成纖維細(xì)胞進行藻酸鹽-多聚賴氨酸-藻酸鹽(alginate-poly-lysine-alginate,APA)半透膜聚合物微囊包裹后植入大鼠紋狀體內(nèi)，以探求用成纖維細(xì)胞進行腦內(nèi)異種移植治療帕金森病實際應(yīng)用的可能性。材料和方法1.大鼠PD模型的建立將體重190200g的雌性SD大鼠(首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供)用6%水和氯醛(0.05ml/kg腹腔注射)麻醉，置于腦立體定位儀行開顱手術(shù)

10、；在腦內(nèi)兩點定位注射1%6-OHDA(6-hydroxydopamine, Sigma)各4l5，以損毀腦一側(cè)黑質(zhì)神經(jīng)元。術(shù)后1周，大鼠頸部皮下注射Apomorphine(0.05mg/kg)，然后置于PD大鼠模型旋轉(zhuǎn)記錄儀6上進行行為學(xué)檢測。每周1次，每次40min，連續(xù)測量4周；出現(xiàn)向損毀對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7圈min的大鼠可視為PD動物模型，共38只，供腦移植用。2.運載細(xì)胞人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)取臨床消毒后流產(chǎn)胎兒(胎齡4個月)皮膚，剪碎后用0.1%胰蛋白酶消化30min，血清中和后離心去上清；Hank液洗12遍，用含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基(DEMEFCS，GibcoBL)反復(fù)吹打，制

11、成細(xì)胞懸液；將其按5×1054 DNA連接酶作用(12，過夜)下進行連接反應(yīng)，兩者連接后可使hTH基因插入載體中。然后轉(zhuǎn)化到XL1-Blue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑選轉(zhuǎn)化后過夜生長的12個連接轉(zhuǎn)化菌落，用煮沸法從中小量提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI和BamHI進行酶切和電泳分析，以驗證質(zhì)粒是否攜帶hTH基因和其插入方向是否正確。經(jīng)確認(rèn)后，用堿裂解法大量提取質(zhì)粒pLhTHSN以用于基因轉(zhuǎn)移。4.pLhTHSN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞用含hTH基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLhTHSN用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染單向包裝細(xì)胞系-2，48h后收集含-2細(xì)胞出芽的病毒顆粒的上清，感染雙相

12、包裝細(xì)胞系PA317；用G418對PA317進行篩選，對形成的抗G418細(xì)胞克隆分別進行擴增培養(yǎng)，并用抗人TH的單克隆抗體進行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色；當(dāng)抗性細(xì)胞表現(xiàn)為TH免疫組織化學(xué)染色陽性而表明有TH基因表達后，大量擴增培養(yǎng)，收集病毒上清；用整合有pLhTHSN的PA317細(xì)胞克隆產(chǎn)生的病毒上清感染人成纖維細(xì)胞，用抗人TH抗體進行免疫組織化學(xué)染色；經(jīng)證實能表達TH后，將細(xì)胞大量擴增，制成細(xì)胞懸液用于微囊化處理和大鼠紋狀體內(nèi)移植。5.微囊化轉(zhuǎn)人TH基因的成纖維細(xì)胞將轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞送301醫(yī)院臨床基礎(chǔ)研究所，用微囊靜電發(fā)生器進行微囊化處理，微囊為APA微囊7。6.轉(zhuǎn)入TH基因的成纖維細(xì)胞大鼠紋

13、狀體內(nèi)移植將PD大鼠模型作為宿主動物分為3組，微囊化人成纖維細(xì)胞移植組(組)和未微囊化人成纖維細(xì)胞移植組(組)各15只，空囊移植組(C組)8只作為對照組。3組動物均經(jīng)腹腔注射6%水和氯醛(0.05ml/kg)麻醉，置于腦立體定位儀上，進行開顱手術(shù)。將上述轉(zhuǎn)入TH基因的微囊化和未微囊化的人成纖維細(xì)胞，按照每只1×106的細(xì)胞數(shù)，分別為15l和20l細(xì)胞懸液，分兩點立體定位注射到大鼠PD模型一側(cè)腦內(nèi)紋狀體(尾殼核)內(nèi)。在對照組的大鼠腦內(nèi)移植空囊懸液。7.行為學(xué)及形態(tài)學(xué)檢測在經(jīng)相同方法進行移植后，術(shù)后動物分別存活216周。對上述3組植入不同移植物的動物按照不同的存活時間分成小組，所有動物都

14、在術(shù)后按前述制作模型的方法進行旋轉(zhuǎn)實驗。根據(jù)不同的存活期灌殺動物，即經(jīng)升主動脈先注入溫生理鹽水200ml，然后注入4含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)250 ml；灌殺后立即取腦，置于含30%蔗糖的4%多聚甲醛中后固定24h后，進行冰凍連續(xù)切片(50m)，將切片分組后分別行TH，膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(glial-fibrillary-acidic-protein,GFAP)和CD8免疫組織化學(xué)染色，即順序?qū)⑶衅敕謩e用小鼠抗TH抗體(11 000，Sigma公司)、GFAP抗體和單克隆小鼠抗T細(xì)胞CD8抗體(1100，DAKO公司)作為一抗、用生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1

15、300,Vector公司)作為二抗和HRP標(biāo)記的抗生物素復(fù)合物作為三抗的0.1mol/L磷酸緩沖液中，然后用含0.5%DAB的0.1mol/L磷酸緩沖液進行染色，以顯示其免疫活性。染色后取部分切片進行焦油固紫復(fù)染。結(jié)果     1新構(gòu)建的質(zhì)粒pLhTHSN基因，其中TH基因插入方向正確Fig.1 The gene map of the reconstructed plasmid pLhTHSN.2.轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的基因表達將新構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLhTHSN導(dǎo)入培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞，23d后，TH免疫組織化學(xué)方法染色可見50%細(xì)胞被染成棕色(2)，顯示

16、有TH表達。3.微囊化細(xì)胞的體外培養(yǎng)經(jīng)微囊包裹后，光鏡下體外觀察可見細(xì)胞存活(3)，細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時間增長；存活細(xì)胞中也可見細(xì)胞的重影和碎片，這主要發(fā)生在囊的中央。對微囊化細(xì)胞的TH染色在任何時間均呈陽性。    2pLhTHSN轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后的TH免疫細(xì)胞化學(xué)染色。示TH反應(yīng)陰性細(xì)胞，其他均為TH反應(yīng)陽性細(xì)胞×200Fig.2The immunocytochemical staining of TH in pLhTHSN transfected human fibroblasts. Arrows indicate TH-negative

17、fibroblasts, the other fibroblasts are TH-positive.×200    3微囊化轉(zhuǎn)TH基因的人成纖維細(xì)胞×40Fig.3 Microcapsulated TH-expressed human fibroblast.×40    4移植后PD大鼠模型腦切片。TH免疫細(xì)胞化學(xué)染色。a. 微囊化轉(zhuǎn)TH基因細(xì)胞移植組(組)的TH免疫細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活2周。示微囊化的細(xì)胞。示微囊×200b. 未微囊化轉(zhuǎn)TH基因細(xì)胞移植組(組)的TH免疫

18、細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活16周。示移植物×100Fig.4 Photomicrograph of the immunocytochemical staining of TH in the brain section of the PD rat model after transplantation.a, The immunocytochemical staining of TH in microcapsulated TH-expressed human fibroblasts transplantation group( Group).The arrow indicates the m

19、icrocapsulated fibroblasts. The triangle indicates the microcapsule. The post-transplantation time is 2 weeks.×200b, The immunocytochemical staining of TH in non-microcapsulated TH-expressed human fibroblasts transplantation group( Group). The arrow indicates the graft. The post-transplantation

20、 time is 16 weeks.×100    5移植后PD大鼠模型腦切片CD8免疫細(xì)胞化學(xué)染色。a.微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組(組)的CD8免疫細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活2周。示微囊×100b.未微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組(組)的CD8免疫細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活2周。示移植物×100Fig.5 Photomicrograph of the immunocytochemical staining of CD8 in the brain section of the PD rat model after transplantation

21、.a, The immunocytochemical staining of CD8 in microcapsulated TH-expressed human fibroblasts transplantation group( Group). The triangle indicates the microcapsule. The post-transplantation time is 2 weeks. ×100b, The immunocytochemical staining of CD8 in non-microcapsulated TH-expressed human

22、fibroblast transplantation group( Group). The arrow indicates the graft. The post-transplantation time is 2 weeks. ×100    6移植后PD大鼠模型腦切片GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色。a.微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組(組)的GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活4周。示微囊×100b.未微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組(組)的GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，術(shù)后存活4周。示星型膠質(zhì)細(xì)胞示移植物×100Fig.6 Photomicrogra

23、ph of the immunocytochemical staining of GFAP in the brain section of the PD rat model after transplantation.a, The immunocytochemical staining of GFAP in microcapsulated TH-expressed human fibroblasts transplantation group( Group). The triangle indicates the microcapsule. The post-transplantation t

24、ime is 4 weeks.×100b,The immunocytochemical staining of GFAP in non-microcapsulated TH-expressed human fibroblasts transplantation group( Group). The arrows indicate the astrocytes. The triangle indicates the graft. The post-transplantation time is 4 weeks. ×1004.動物行為的檢測實驗動物組和組在移植手術(shù)后1周行為即有

25、改變：組動物的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)由術(shù)前12.1圈min(n=15)減少至3.7圈min(n=15)，持續(xù)到16周；組動物的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)由術(shù)前11.9圈min(n=15)減少至5.6圈min(n=13)；C組動物的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)術(shù)前術(shù)后均為13.7圈min(n=8)(7)。     7PD動物模型腦內(nèi)移植轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞前后單側(cè)旋轉(zhuǎn)測試Fib.7 The rotation test of PD rat modelpre-and post-transplantation.5.腦內(nèi)移植物形態(tài)學(xué)檢測在動物不同存活期腦切片上可見：組動物腦內(nèi)可見呈球形微囊輪廓的移植物，囊中有深棕色TH

26、免疫反應(yīng)的成纖維細(xì)胞(4a)，移植物周圍(囊外)有TH免疫反應(yīng)物質(zhì)浸潤；移植物細(xì)胞和浸潤區(qū)的大體數(shù)量和范圍在16周內(nèi)無明顯變化。組動物腦內(nèi)移植物也呈深棕色TH免疫反應(yīng)，周圍也有TH免疫反應(yīng)物質(zhì)浸潤，但隨時間延長其表達下降，從第8周起范圍明顯減少，第16周時僅見少量(4b)，有時還出現(xiàn)壞死。C組動物腦內(nèi)未出現(xiàn)TH陽性反應(yīng)。組動物移植位點周圍GFAP和CD8免疫反應(yīng)相對較強烈，出現(xiàn)深棕色CD8陽性顆粒(5b)，GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞多且明顯(6b)；組動物和C組動物移植位點周圍GFAP和CD8免疫反應(yīng)相似，CD8陽性顆粒(5a)和GFAP陽性細(xì)胞(6a)數(shù)量和范圍少于組動物。討論本研究是將能表

27、達TH基因的pLhTHSN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人成纖維細(xì)胞，再經(jīng)APA人工半透膜包囊后植入PD大鼠模型紋狀體內(nèi)。實驗證明，它與未微囊化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞一樣能有效改善PD大鼠模型的不正常運動行為。不僅如此，微囊化的異種轉(zhuǎn)TH基因細(xì)胞在腦內(nèi)引起的免疫排斥反應(yīng)比未微囊化的細(xì)胞小，預(yù)示其能存活和表達更長時間。因此可以認(rèn)為，APA半透膜微囊包裹既對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的營養(yǎng)無明顯不利影響，又能在異體移植中對宿主的免疫排斥反應(yīng)起隔離作用。從以往研究8，9看，植入的微囊化細(xì)胞在體內(nèi)的存活狀況可能與某些因素有一些關(guān)系。其中靶細(xì)胞選擇有一定的作用。有報道指出，成纖維細(xì)胞是一種廣泛使用、適合于基因工程改造的供移植的細(xì)胞，即它易于獲取、能夠

28、在體外培養(yǎng)、植入腦內(nèi)不易形成腫瘤。本研究證明，在體內(nèi)和體外不同的環(huán)境中，轉(zhuǎn)入TH基因的成纖維細(xì)胞在微囊內(nèi)皆存活良好，能較好表達TH活性。由此可知，成纖維細(xì)胞是一種可供臨床基因治療選擇的運載細(xì)胞。其次，移植位點選擇也有一定影響。有報道說，當(dāng)移植微囊化PC12細(xì)胞治療PD時，移入側(cè)腦室并無效果，而移入紋狀體內(nèi)則有明顯效果10，這說明囊內(nèi)細(xì)胞分泌的物質(zhì)必須擴散到靶組織中才有作用。本研究實驗結(jié)果證實了微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可在紋狀體內(nèi)長期存活，可以明顯改善動物模型的單側(cè)旋轉(zhuǎn)運動。但從切片看，其TH擴散程度有限。因此，多點、多量定位移植是使用微囊化細(xì)胞移植必需考慮的因素。移植細(xì)胞的數(shù)量和體積直接影響到移植手術(shù)

29、的復(fù)雜程度和移植物的存活度。大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)活性物質(zhì)的需求量相對較少，一般移植的細(xì)胞數(shù)目約為106107個，因此從理論上講，微囊技術(shù)更適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的移植。本研究各組所移植的細(xì)胞數(shù)目基本相同(1×106)，但由于微囊化后所占體積增大，因此移植物的體積比以往實驗有所加大11(20l)。體積加大對腦組織的影響尚需進一步觀察，但從本研究看，尚未見到其有顯著影響。盡管腦是免疫“豁免”部位，但這種“豁免”并不是絕對的3。本實驗中未微囊化細(xì)胞組移植部位TH免疫反應(yīng)細(xì)胞在第8周后顯著減少，呈現(xiàn)一定的免疫排斥現(xiàn)象；而微囊化細(xì)胞組則未見明顯排斥，這說明人工微囊確實起到了免疫隔離的作用。本研

30、究顯示微囊化組盡管比未微囊化組的免疫反應(yīng)較弱，但仍然存有免疫反應(yīng)。這表示微囊并不能做到絕對的免疫隔離。微囊對巨嗜細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞所分泌的一些低分子量的物質(zhì)，如對細(xì)胞具有非特異性毒性的細(xì)胞因子(1030kD)、自由基、H2O2和NO等并不能起到隔離作用12；微囊壁上的孔徑并不均一，呈正態(tài)分布，部分小孔面積足以允許抗體和補體通過13。這些都會影響移植物在體內(nèi)的長期存活，但微囊化后的異種細(xì)胞在植入腦內(nèi)后遭受宿主的免疫排斥畢竟較小。另外，還需進一步研究營養(yǎng)支持對微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的影響。Tomac等14曾報告，在腦內(nèi)用膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)對黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)具有保護和恢復(fù)雙重功能。已

31、證實將牛嗜鉻細(xì)胞與一種分泌NGF的細(xì)胞系一同微囊化后移植，可顯著增加DA的釋放，改善異常的旋轉(zhuǎn)行為15。因此將來應(yīng)考慮用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和分泌生長因子的細(xì)胞一同微囊化后移植以實施基因治療的戰(zhàn)略。無論如何，微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞異體移植對PD動物模型的基因治療顯示了有價值的應(yīng)用前景，這對基因治療的臨床應(yīng)用具有重要意義。本實驗中微囊化處理得到了301醫(yī)院臨床基礎(chǔ)研究所薛毅瓏教授的大力幫助，謹(jǐn)致謝意。本文26見插第8頁【基金項目】國家自然科學(xué)基金國際合作項目【作者簡介】戴曉玲(1972)，女(漢族)，吉林市人，碩士，講師戴曉玲（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）張進祿（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研

32、究所，北京100054）徐群淵（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）趙春禮（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）趙煥英（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）孫曉紅（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）鄭少鵬（首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京100054）參考文獻1During MJ, Naegele JK, O'Malley KL, et al. Long-term correction of rat model of Parkinsoniam rats by a HSV vector expressing tyrosine

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