維拉帕米在應力對體外骨髓間充質(zhì)干細胞早期反應基因蛋白表達中作

1、維拉帕米在應力對體外骨髓間充質(zhì)干細胞早期反應基因蛋白表達中作用的研究         10-05-03 14:34:00     編輯：studa20             作者：黎潤光，邵景范，魏明發(fā)，趙東明，王鋼陳濱，任高宏 【摘要】  目的研究維拉帕米(Verapamil)在周期性牽張應力對體外骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs

2、)早期反應基因蛋白表達中的作用，從而進一步推斷出Ca2+ 通道在細胞響應力學的信號傳導途徑中的作用。方法分離并培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，利用體外細胞牽張應力裝置對第36代細胞加載力學信號，在應力干預細胞前加及不加鈣離子拮抗劑（維拉帕米），受力結(jié)束后，流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)鈣離子熒光強度，用RTPCR以及免疫組化的方法檢測各組細胞內(nèi)cfos、cjun和cmyc基因蛋白表達的情況。結(jié)果加載力學信號后，細胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生改變，cfos、cjun和cmyc基因蛋白的表達明顯增強(P<0.01)，經(jīng)維拉帕米預處理后，以上生物學效應受到抑制(P<0.01)。結(jié)論在牽張應力作用下骨髓間充質(zhì)干細胞Ca

3、2+內(nèi)流發(fā)生了變化，并且這種變化在骨髓間充質(zhì)干細胞對周期性牽張應力的早期應答反應中起到了部分作用,可能依賴鈣離子通道的活化來調(diào)控。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細胞； 牽張應力； cfos； cjun； cmyc； 維拉帕米    Abstract：ObjectiveTo study the effects of verapamil on the immediateearly gene(IEGs) expression of bone marrow mesenchymal stimulated by mechanical strain,and deduce

4、 the effects of calcium ion channel on the early responses of children bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)to mechanical strain in vitro.MethodMSCs were isolated and cultured.The 3-6th generational MSCs were stimulated in different time by mechanical and (or) verapamil（20mol/l）.Flow cytometry w

5、as applied to measure intracellular free Ca2 at once.Earlyresponse genes /proteins （cfos,cjun and cmyc）were examined by RTPCR and immunocytochemical stain.ResultThe application of mechanical strain  increased intracellular cfos,cjun and cmyc mRNA /protein levels.The resulting effect is partiall

6、y inhibited before MSCs were preincubated with verapamil (P<0.01).ConclusionMechanical strain could change intracellular free calcium ion concentration of bone marrow mesenchymal stem cells,which was partially inhibited by verapamil,and the change playes a key role in early response of MSCs 

7、 to mechanical loading.    Key words：mesenchymal stem cells (MSCs);  strain;  cfos;  cjun;  cmyc;  verapamil    力學因素在各種組織細胞中起重要的調(diào)控作用。骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）是體內(nèi)成骨和骨重建的細胞學基礎。體外研究表明，適當?shù)膽纱龠MMSCs增殖及向成骨分化1、2，而過度的應力則對MSCs造成一定的損傷3、4。細胞響應

8、機械應力的早期反應相當復雜5。鈣離子被認為是細胞內(nèi)最重要的第二信使之一，對細胞各種生理活動具有廣泛調(diào)控作用。胞內(nèi)Ca2極少，當細胞受到理化因素等外界刺激后，胞漿Ca2濃度大幅度增加。cfos、cjun、cmyc等是細胞響應力學信號的重要中間產(chǎn)物，受刺激后短時間后即可檢測到這些基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。但這些基因誘導表達非常短暫，其mRNA壽命也很短，而且誘導這些基因不依賴于新蛋白的合成，故也稱之為早期反應基因，它們能夠激活下游調(diào)節(jié)分泌蛋白酶細胞因子，啟動促進細胞增殖分化等生物效應。維拉帕米（Verapamil）是一種選擇性鈣拮抗劑，能阻斷L型Ca2通道。在加載力學信號的培養(yǎng)細胞中加入一定濃度的Ver

9、apamil預處理，觀察其在MSCs內(nèi)Ca2以及早期反應基因表達的情況，以推斷細胞響應應力的早期反應依賴于鈣離子通道的活化。    1  材料與方法    1.1  主要儀器及試劑    DMEMLG培養(yǎng)基（Gibco），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Hyclone），維拉帕米（Alexis），Trizol細胞裂解液（Sigma），胰蛋白酶及瓊脂糖（Amersco），RT及PCR試劑盒（TaKaRa），鈣離子探針fluo4/AM（invitrogren）、cfos、cjun、cmyc一抗（Santa&

10、#160; cruz），sp法二抗試劑盒（北京中衫），各引物（上海英峻基因生物公司）等；主要儀器包括參考Schaffer等6的方法自行建立的體外細胞牽張力學裝置（其結(jié)構(gòu)與原理見文獻7）、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本)、流式細胞儀（BD公司，美國）、分光光度計(島津1240紫外，日本)、PCR儀（Eppendorf，美國）等。    1.2  細胞取材與培養(yǎng)    MSCs取自先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良行骨盆截骨術(shù)的患者（69歲，征得患者及家屬同意），術(shù)中髂前上棘無菌穿刺取材，Percoll淋巴分離液密度梯度法分離MSCs細

11、胞，接種于LDMEM10胎牛血清雙抗（100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素）中，置37、5CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱原代培養(yǎng)，換液傳代，反復貼壁純化，并進行增殖活性以及多向分化潛能檢測8。    1.3  應力及維拉帕米對細胞內(nèi)Ca2+的影響    取第36代細胞，以每孔1.5×105/2 ml的密度接種于6孔彈性硅膠膜培養(yǎng)板（Flexcell，USA）內(nèi)培養(yǎng)，次日細胞貼壁，待細胞完全覆蓋培養(yǎng)基膜后，分組干預細胞（維拉帕米在細胞受力前30 min加入，濃度為20 mol/L9），如表1，力學參數(shù)為正弦波

12、形，頻率為1 Hz、強度為12，各組細胞來源一致，不受應力刺激組除不受牽張應力刺激外，其他條件與受力組保持一致；各組實驗均放置細胞培養(yǎng)箱里進行。各組細胞受刺激結(jié)束后，立即行細胞內(nèi)鈣離子的檢測，用細胞外液洗滌2次，按照說明書原位加載fluo4/AM，37避光孵育30 min，去除上清，細胞外液清洗細胞3次，以徹底去除細胞外殘留的探針，胰酶消化離心收集細胞，制成細胞懸液，上流式細胞儀檢測熒光強度，檢測波長為488 nm。 表1  實驗分組以及干預條件組別受力刺激時間有無加入維拉帕米預處理    1.4  應力及維拉帕米對細胞內(nèi)cfos、cjun和c

13、myc表達的影響    另取細胞分4組，A（力-、V-）、B（力-、V）、C（力、V）、D（力、V-），受力組加載力學信號1 h，余參數(shù)同上。實驗結(jié)束后，收集標本以行RTPCR、免疫細胞化學檢測各指標mRNA以及蛋白表達。由英峻公司合成引物（表2），Trizol裂解提取各組細胞RNA，常規(guī)RTPCR，將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上點樣電泳，GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察并分析各條帶；細胞實驗結(jié)束后，PBS漂洗3次，4多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，剪下硅膠膜，裁成小片狀，0.2triton破膜，參照試劑盒說明書，按順序加入封閉液、一抗（180稀釋）、二

14、抗，DBA顯色，鏡下觀察，并進行細胞染色灰度值定量分析。表2  cfos、cjun、cmyc以及內(nèi)參的引物設計基因    1.5  數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析    實驗所得數(shù)據(jù)均以±s表示，各參數(shù)之間的差異顯著性應用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5進行單因素方差分析數(shù)據(jù)。    2  結(jié)  果    2.1  活體細胞的形態(tài)排列顯微鏡觀察    原代細胞接種后24 d開始貼壁，呈成纖維樣梭形。第34 d首次換液后即可見細胞迅速增殖，呈克隆樣生長，經(jīng)多次換液及PBS洗滌后，造血細胞逐漸被清除。1214 d細胞融合達80 。傳代后的MSCs生長速度增快，710 d可鋪滿培養(yǎng)瓶底，呈細長梭形旋渦狀分布直至融合細胞消化后接種于底部為硅膠膜的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，生長良好，培養(yǎng)約48 h，細胞覆蓋率達80，經(jīng)周期性牽張應力或（和）維拉帕米短暫干預后，各組細胞形態(tài)未見明顯差別，未見脫壁、破裂等現(xiàn)象。    2.2  各組刺激對小兒MSCs游離鈣離子的影響    如圖1所示，骨髓間充質(zhì)干細胞受不同時間應力作用后，胞內(nèi)鈣離子的