納米羥基磷灰石混旋聚乳酸修復(fù)牙槽突裂的實(shí)驗(yàn)研究

1、納米羥基磷灰石納米羥基磷灰石/ /混旋聚乳酸修復(fù)牙槽突裂的實(shí)驗(yàn)研混旋聚乳酸修復(fù)牙槽突裂的實(shí)驗(yàn)研究究作者：胡圖強(qiáng)， 何 俐*， 喻學(xué)洲， 周永慶 作者單位：(鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院口腔科,湖北 十堰 442000)【摘要】 目的:研究納米羥基磷灰石/混旋聚乳酸(nanoHA/PDLLA)復(fù)合材料修復(fù)牙槽突裂的愈合過程。方法:將 40 只雄性日本大白兔隨機(jī)平均分成nanoHA/PDLLA 和 nanoHA 兩組。每只動(dòng)物的兩側(cè)下頜骨均外科形成類似牙槽突裂樣缺損。2 個(gè)月后各組動(dòng)物分別以上述兩種材料充填修復(fù)牙槽突裂,于 2周、4 周、8 周、12 周和 24 周處死動(dòng)物，采用組織學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等方法

2、觀察樣本。結(jié)果:所有動(dòng)物均無圍術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生。術(shù)后 8 周內(nèi) nanoHA/PDLLA 組的成骨活性明顯低于對(duì)照組，而在 12 周后兩組間無明顯差異。術(shù)后第 12 周，兩組材料均基本吸收。術(shù)后第 24 周，nanoHA/PDLLA 組和對(duì)照組新骨平均喪失高度分別為修復(fù)高度的 32.1%和 12.4%。結(jié)論:nanoHA 是牙槽突裂修復(fù)的良好生物材料， nanoHA/PDLLA 由于其對(duì)新骨形成的抑制作用和新骨吸收比例較高，需作進(jìn)一步研究?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】 納米羥基磷灰石納米羥基磷灰石; ;混旋聚乳酸混旋聚乳酸; ;牙槽突裂牙槽突裂; ;修復(fù)修復(fù)Experimental Study on A

3、lveolar Cleft Repaired with NanoHA/PDLLAHU Tuqiang,HE Li,YU Xuezhou，ZHOU Yongqing (Department ofStomatology, Renmin Hospital, Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei442000,China)Abstract:Objective To investigate the healing process of alveolarcleft repaired with NanoHA/PDLLA. Methods Forty male Japanes

4、erabbits were randomly divided into NanoHA/PDLLA group and NanoHAgroup.Alveolar clefts were made by severing the mandible of eachside,then repaired with the two kinds of materials respectively twomonths later.The animals were sacrificed at 2, 4, 8, 12 and 24 weekspostoperation. Histological and hist

5、omorphometric evaluation werecarried out.Results There were no complication in all animals.Theactivity of osteblast in nanoHA/PRP group was significantly lowerthan that in control within 8 weeks after operation, but nosignifiant after 12 weeks.The materials were absorbed completely inboth groups 12

6、weeks postoperation.The proportion of average heightof new forming bone lost in nanoHA/PDLLA group was 32.1%,while itwas 12.4% in the control group 24 weeks postoperation.ConclusionNanoHA/PDLLA is a good biomaterial in repair of alveolarcleft,whereas its inhibitory effect and high absorption ratio o

7、f newbone need further study.Key words:NanoHA;PDLLA;Alveolar cleft;Repair牙槽突裂的修復(fù)主要是恢復(fù)上頜骨的連續(xù)性，為裂隙鄰近和未萌出牙提供骨支持，并封閉口鼻瘺和前腭裂。牙槽突裂修復(fù)多采用自體松質(zhì)骨移植，但存在供區(qū)并發(fā)癥、愈合時(shí)間延長(zhǎng)、后期骨吸收和治療費(fèi)用增加等問題，所以采用生物材料修復(fù)是一種新的探索。羥基磷灰石由于不能吸收不宜用于牙槽突裂修復(fù)。納米羥基磷灰石組織相容性好，在體內(nèi)可以完全吸收，已證實(shí)可用于骨組織缺損和牙槽突裂修復(fù)1，但因材料是粉狀，臨床上不易操作。本研究的目的是通過研究納米羥基磷灰石/混旋聚乳酸(nanoHA

8、/PDLLA)復(fù)合材料修復(fù)牙槽突裂的愈合過程，探討其生物性能。1 材料和方法1.1 材料PDLLA/nanoHA 由武漢理工大學(xué)生物材料中心提供，PDLLA 分子量(MV)為1.06105，復(fù)合材料是在 PDLLA 中加入 10%wt 的 nanoHA 復(fù)合而成。1.2 動(dòng)物將 40 只體重 2.53.0 kg 的雄性日本大白兔隨機(jī)平均分成 nanoHA 組和nanoHA/PDLLA 組。將各組動(dòng)物隨機(jī)分配到 2 周、4 周、8 周、12 周和 24 周 5個(gè)時(shí)間段中，每個(gè)時(shí)間段 4 只，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)單籠飼養(yǎng)。1.3 建立牙槽突裂動(dòng)物模型和牙槽突裂修復(fù)術(shù)前手術(shù)部位剪毛，碘伏消毒。所有動(dòng)物均在全

9、麻下進(jìn)行手術(shù)，通過耳緣靜脈注射質(zhì)量濃度為 20 g/L 的戊巴比妥鈉，30 mg/kg。于兩側(cè)下頜骨體部無牙區(qū)外科形成長(zhǎng) 7 mm、高 5 mm 牙槽突裂樣楔形缺損。動(dòng)物模型建立 2 個(gè)月后，同樣在全麻下行牙槽突裂修復(fù)術(shù)。每只動(dòng)物兩側(cè)均植入相同材料。為了減少圍術(shù)期感染，術(shù)中和術(shù)后連續(xù) 3 d 給予 15%氨芐青霉素 3 mL/kg 肌肉注射。于術(shù)后 2 周、4 周、8 周、12 周和 24 周處死動(dòng)物。1.4 組織形態(tài)學(xué)檢查使用精確度 0.02 mm 數(shù)顯游標(biāo)卡尺在骨標(biāo)本上直接測(cè)量新骨表面最低點(diǎn)與相鄰固有牙槽嵴頂之間的垂直距離為新骨骨吸收量，取三次測(cè)量的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)量和統(tǒng)計(jì)均由一人

10、完成。1.5 組織學(xué)檢查注射過量苯巴比妥鈉處死動(dòng)物,于植入材料外側(cè) 3 mm 處行塊狀截骨，取出后以砂輪橫向片切成兩部分。一部分置于 4%的多聚甲醛固定 48 h 后，流水沖洗 24 h，然后置于 10%的 EDTA 中脫礦，制成石蠟標(biāo)本，5 m 切片，HE 染色。另一部分置于中性 3%戊二醛中固定 48 h，切取 0.5 cm0.4 cm0.2 cm 包含材料骨組織交界面的骨組織塊，pH=7.3 PBS 液沖洗， 1%四氧化鋨固定液固定 1h，梯度酒精、丙酮脫水。干燥后噴金，掃描電鏡(S570 Hitachi,日本)觀察。剩余部分經(jīng) PBS 液充分沖洗，4.5%EDTA 脫鈣，pH=7.3

11、PBS 液沖洗，1%四氧化鋨固定，梯度酒精、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂定向包埋 0.1 m 超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(JM1200)觀察。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用 SAS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P0.05 有顯著差異。2 結(jié)果2.1 大體觀察所有動(dòng)物均無圍手術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生。人工牙槽突裂形態(tài)大小基本一致，平均高約 4.2 mm，牙槽嵴處平均裂隙寬約 6.4 mm。術(shù)后第 24 周，兩組材料均基本吸收。2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察每個(gè)標(biāo)本于新骨表面取最低點(diǎn)，千分位游標(biāo)卡尺測(cè)量其至相鄰固有牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x，精確到 0.02 mm。表 1 是每個(gè)時(shí)間段新骨表面最低點(diǎn)至牙槽嵴頂?shù)拇怪?/p>

12、距離。表 1 新形成骨表面最低點(diǎn)至牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x(xs,mm)材料/時(shí)間 2 周 4 周 8 周 12 周 24 周 NanoHA 組0.16+0.030.31+0.080.41+0.090.50+0.100.52+0.10nanoHA/PDLLA 組0.34+0.050.60+0.090.79+0.101.22+0.141.35+0.17兩組各時(shí)間段比較，P 均0.052.3 光鏡觀察術(shù)后 2 周， nanoHA 組纖維組織較豐富，近固有骨處成骨細(xì)胞豐富，可見少量骨痂，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖 1)。nanoHA/PDLLA 組有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，植入材料與固有骨接觸處見到少量成纖維細(xì)胞、

13、成骨細(xì)胞和骨樣組織，并可見較大空隙(圖 2)。術(shù)后 4 周和 8 周，nanoHA 組有大量骨痂形成，骨痂改建明顯;nanoHA/PDLLA 組仍可見到少量炎性細(xì)胞，骨小梁疏松，纖維組織較多。2.4 電鏡觀察透射電鏡觀察，術(shù)后第 2 周，nanoHA 組固有骨與材料之間可見到大量成骨細(xì)胞，成長(zhǎng)柱形，胞核大，成卵圓形或梭形，含染色質(zhì)顆粒，核仁明顯。有豐富的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖 3)。nanoHA/PDLLA 組成骨細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，功能不活躍(圖 4)。圖 3 術(shù)后第 2 周，nanoHA 組可見大量成骨細(xì)胞，有豐富的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(10 000)。圖 4 nanoHA/PDLL

14、A 組成骨細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，功能不活躍(10 000)。掃描電鏡觀察，術(shù)后第 8 周，nanoHA 組可見到較多骨髓組織及成熟骨細(xì)胞，固有骨與新骨之間為直接骨性結(jié)合，界面仍可清楚區(qū)別。植入材料已基本吸收，大量新骨已改建成板層骨(圖 5)。nanoHA/PDLLA 組可以見到較大顆粒，有大量新骨形成(圖 6)。圖 5 術(shù)后第 8 周，nanoHA 組可見到較多骨髓組織及成熟骨細(xì)胞，固有骨與新骨之間為直接骨性結(jié)合，界面仍可清楚區(qū)別。植入材料已基本吸收，大量新骨已改建成板層骨(3 500)。圖 6 術(shù)后第 8 周，nanoHA/PDLLA 組可見到較大顆粒，有大量新骨形成(3500)。3

15、討論牙槽突裂影響語音功能，并影響到牙胚，導(dǎo)致受累牙的數(shù)目、形態(tài)以及位置發(fā)生變化，導(dǎo)致口頜畸形。目前牙槽突裂的手術(shù)修復(fù)主要采用自體髂骨松質(zhì)骨移植。近年來，許多學(xué)者熱衷于骨替代材料的研究，用于骨缺損修復(fù)，包括各種生物材料及添加生長(zhǎng)因子。牙槽突裂修復(fù)材料與一般骨缺損修復(fù)材料相比，既有相同之處，又有其特殊要求。與一般骨修復(fù)材料相比，牙槽突裂修復(fù)材料還應(yīng)具有以下特性：骨誘導(dǎo)性;能夠吸收，而且可控制在一定時(shí)間內(nèi);促成骨作用。納米羥基磷灰石微結(jié)構(gòu)類似天然骨基質(zhì)，對(duì)細(xì)胞和生物材料之間的相互作用影響很大，在許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面發(fā)揮了重要作用。在一些實(shí)驗(yàn)中納米羥基磷灰石表現(xiàn)出了良好的生物相容性2-3，除了能在一定

16、時(shí)間內(nèi)吸收外，具有更良好的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能4-5?；煨廴樗崾且环N非結(jié)晶態(tài)的聚乳酸，具有組織相容性好、在體內(nèi)能夠完全降解等特點(diǎn)，已大量用于骨缺損修復(fù)和頜骨骨折內(nèi)固定。然而，由于 PDLLA分子量低，其降解速度過快。未吸收的降解產(chǎn)物堆積過多，將影響到局部血流量和 pH 值，降低成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活性，從而延緩了骨愈合過程6。近年來，一些學(xué)者利用工藝將 HA 和 PDLLA 混合在一起，既可增加 PDLLA 的強(qiáng)度和韌度，又便于 HA 成形，廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)，取得較好效果。Liao 等1-2,7-8將 nanoHA 與 PLLA、膠原、聚氨基葡糖、聚合物等復(fù)合，用于骨組織缺損修復(fù)或骨組織

17、工程技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)中， nanoHA/PDLLA 便于成形，易于操作。PDLLA 降解時(shí)產(chǎn)生的乳酸改變了局部骨組織的 pH 值，影響堿性磷酸酶活性，對(duì)骨愈合有一定的抑制作用;復(fù)合材料中 nanoHA 在酸性環(huán)境中溶解增速，溶解釋放的 Ca2+,PO43離子可能參與局部骨基質(zhì)的鈣化，并且糾正局部骨組織的 pH 值，對(duì)新骨的形成和骨結(jié)合有促進(jìn)作用9-10。而且 PDLLA 降解時(shí)產(chǎn)生的空隙有利于成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的長(zhǎng)入，可能縮短材料吸收時(shí)間和影響新骨形成與改建過程。整個(gè)觀察過程中，nanoHA 與 nanoHA/PDLLA 組牙槽突裂植骨部位均正常愈合，表現(xiàn)出良好的生物相容性，無排斥反應(yīng)

18、。材料植入早期，材料與固有骨之間有豐富的毛細(xì)血管長(zhǎng)入，材料周圍有大量成骨細(xì)胞。12 周時(shí)材料明顯吸收，24 周時(shí)材料吸收完全，新骨形成和改建基本完成。這提示了 nanoHA 對(duì)骨折愈合過程干擾作用很小11。nanoHA 在體內(nèi)的吸收時(shí)間和骨改建時(shí)間大約 6 個(gè)月左右，盡管比自體松質(zhì)骨移植的骨形成和骨改建時(shí)間長(zhǎng)，但不會(huì)影響尖牙的萌出。然而，一種生物材料能否適宜于牙槽突裂的修復(fù)，除了其能在一定的時(shí)間內(nèi)吸收外還有一個(gè)重要因素，即材料植入后所能提供的新骨骨量。如果新骨量不足，將影響尖牙及牙槽突裂隙鄰近牙的穩(wěn)定性，甚至加大術(shù)后正畸治療的難度。新形成骨表面最低點(diǎn)至牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x為新骨喪失高度，體現(xiàn)了新

19、骨吸收量。nanoHA 組新骨平均喪失高度為 12.4%，這種新骨吸收量基本不會(huì)影響到尖牙的萌出和上頜骨的穩(wěn)定性。而 nanoHA/PDLLA 組第 24 周骨吸收量為32.1%，骨量不足將影響到尖牙和上頜骨的發(fā)育和生理功能，所以認(rèn)為該比例的混合材料不宜用于牙槽突裂的修復(fù)。PDLLA 降解過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的吸收以及降解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的影響可能與新骨吸收量有關(guān)。適當(dāng)調(diào)整 nanoHA 和 PDLLA 的比例，增加混合材料中 nanoHA 的比重，可以減少單位時(shí)間內(nèi) PDLLA 中間產(chǎn)物量，改變局部生理環(huán)境，從而減小其對(duì)新骨形成的抑制作用和新骨吸收量，通過進(jìn)一步研究，n

20、anoHA/PDLLA 有可能成為一種牙槽突裂修復(fù)的良好材料。nanoHA 是牙槽突裂修復(fù)的良好生物材料，該比例的 nanoHA/PDLLA 混合材料由于其對(duì)新骨形成的抑制作用和新骨吸收比例較高，需作進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】1Liao SS, Cui FZ, Zhang W, et al.Hierarchically biomimetic bonescaffold materials: nano-HA/collagen/PLA compositeJ.J Biomed MaterRes B Appl Biomater,2004,69(2):158-165.2Zhu X,Eibl O,Scheid

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