分析化學(xué)中物質(zhì)的分離方法

1、分析化學(xué)中物質(zhì)的分離方法第一章分離方法介紹1.1高速逆流色譜高速逆流色譜（H SCCC）是由美國國家醫(yī)學(xué)院Y ioch iro Ito博士于19 8 2年首先開始的。當(dāng)儀器工作時互不相容的兩相溶劑在繞成線圈的聚四氟乙烯管內(nèi)具有單向性流體動力平衡性質(zhì)。在聚四氟乙烯管內(nèi)做高速行星運轉(zhuǎn)時，如用其中一相溶劑做固定相，則恒流泵可以輸送另一相溶劑載著樣品穿過固定相。由于樣品中各組分在兩相中的分配能力不同，導(dǎo)致在聚四氟乙烯管中移動的速度也不相同，因而能使樣品中各組分得到分離。高速逆流色譜分析方法避免了有效成分被固定相載體不可逆吸附和峰型脫尾等缺點。且H SCCC有樣品粗體物可進(jìn)樣分離，分離純化和制備同步完成

2、，對有機溶劑消耗少，無損害，無污染，高效，快速，可大量制備分離等優(yōu)點。有的樣品經(jīng)一次H SCCC分離就可以得到1個或幾個單體，且分離時間短，幾個小時就可以完成一次分離。與H PLC相比，H SCCC上樣量大，最多可達(dá)到幾克。H SCCC制備分離能力取決于儀器參數(shù)和溶劑體系的選擇，儀器參數(shù)選擇要主義轉(zhuǎn)速，流速和上樣量等幾個方面。轉(zhuǎn)速越高，越容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；流速越大，固定相越容易損失，進(jìn)樣量太大，峰間距窄，峰型變寬。兩相溶劑系統(tǒng)的選擇應(yīng)符合以下原則：第一，溶劑不造成樣品的分解，變性；第二，為保證固定相保留值適合，溶劑體系的分層時間小于30S；第三，上下兩相體積大致相等，以免浪費溶劑；第四，目標(biāo)樣

3、品的分配系數(shù)K接近1，容量因子要大于1.5；第五，盡量采用揮發(fā)性溶劑，以方便后續(xù)處理，易于物質(zhì)純化；第六，分析中，最好用流動相溶解樣品。本試驗根據(jù)對分離物質(zhì)進(jìn)行薄層層析鑒定，初步判定用高速逆流色譜分離的主要成為多酚類黃酮。1.2薄層層析1.2.1 TLC的原理薄層色譜(Th in Layer Ch rom atograp h y)常用TLC表示，又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實驗技術(shù)，屬固液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精制樣

4、品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（103cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。1.2.2 TLC展開劑的選擇選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑是首要任務(wù)，一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概是：石油醚，己烷，苯，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇，

5、甲醇。但是使用單一溶劑往往不能達(dá)到很好的分離效果。通常使用一個高極性和低極性溶劑組合成混合溶劑。展開劑的比例要不斷嘗試，一般根據(jù)文獻(xiàn)中報道的該類化合物用什么展開劑，就首先嘗試使用這類展開劑，然后不斷調(diào)節(jié)比例，直到找到一個分離效果最好的展開劑為止。展開劑的選擇條件：第一，對所需成分有良好的溶解性；第二，可使成分分離開；第三，待測組分的RF值最好在0.20.8之間，定量測定最好在0.30.5之間；第四，不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；第五，展開后組分斑點圓且集中；第六，混和溶劑最好用新鮮配置的。一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇，乙醇，乙酸乙酯來調(diào)節(jié)溶解系統(tǒng)的

6、極性，已達(dá)到好的分離效果，適用于生物堿，黃酮，萜類物質(zhì)的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水組成基本兩相，由甲醇，乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適用于蒽醌，香豆素，以及一些極性較大的木質(zhì)素和tiel的分離；極性強的溶劑由正丁醇和水組成，要同樣靠甲醇，乙醇，乙酸乙酯來調(diào)節(jié)，適用于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達(dá)到最佳效果。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開的跡象,再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑），達(dá)到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開劑

7、里往往加一點點三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質(zhì)來中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質(zhì)，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質(zhì)量很有關(guān)系：不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細(xì)程度，酸性強弱不同，從而導(dǎo)致產(chǎn)品在某個廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質(zhì)含量對分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實驗中我們發(fā)現(xiàn)有時同一展開條件，上下午的Rf截然不同。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。

8、這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過快（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（）來表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水性溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中強。1.2.3顯色劑的選擇根據(jù)樣品中所含物質(zhì)不同，來選擇不同的顯色劑。其中一些還需要烘烤后方可顯色。也要根據(jù)薄層板的材質(zhì)不同來選擇不同的顯色劑，例如，聚酰胺材質(zhì)的薄層板只能用氯化鐵顯色，且不能烘烤。下面是一些具體顯色劑的使用對象

9、和配置方法。碘：適用于不飽和或者芳香族化合物。配制方法：在100m l廣口瓶中，放入一張濾紙，少許碘粒。或者在瓶中，加入10g碘粒，30g硅膠高錳酸鉀：適用于含還原性基團(tuán)化合物，比如羥基，氨基，醛。配制方法：1.5g KMnO4+10g K2CO3+1.25m L10%NaOH+200m L水使用期3個月磷鉬酸(PMA)：適用范圍廣泛。配制方法：10gof磷鉬酸+100m L乙醇紫外燈：適用于含共軛基團(tuán)的化合物，芳香化合物硫酸鈰：適用于生物堿。配制方法：10%硫酸鈰(IV)+15%硫酸的水溶液氯化鐵適用于苯酚類化合物。配制方法：1%FeCl3+50%乙醇水溶液桑色素(羥基黃酮)，適用范圍廣泛,

10、有熒光活性。配制方法：0.1%桑色素+甲醇茚三酮，適用于氨基酸。配制方法：1.5g茚三酮+100m Lof正丁醇+3.0m L醋酸二硝基苯肼(DNP)，適用于醛和酮。配制方法：12g二硝基苯肼+60m L濃硫酸+8 0m L水+200m L乙醇香草醛(香蘭素)適用范圍廣泛。配制方法：15g香草醛+250m L乙醇+2.5m L濃硫酸溴甲酚綠，適用于羧酸，p Ka=5.0。配制方法：在100m l乙醇中，加入0.04g溴甲酚綠，緩慢滴加0.1M的NaOH水溶液，剛好出現(xiàn)藍(lán)色即至。鉬酸鈰，適用范圍廣泛。配制方法：235 m l水+12 g鉬酸氨+0.5 g鉬酸鈰氨+15 m l濃硫酸茴香醛(對甲氧

11、基苯甲醛)1，適用范圍廣泛。配制方法：135乙醇+5 m l濃硫酸+1.5 m lof冰醋酸+3.7 m l茴香醛，劇烈攪拌，使混合均勻。茴香醛(對甲氧基苯甲醛)2，適用于萜烯，桉樹腦(cineoles),with anolid es,出油柑堿(acronycine)。配制方法：茴香醛:H ClO4:丙酮:水(1:10:20:8 0)經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調(diào)整。第二章色譜分離方法2.1色譜分離法的原理和分類色譜分離法（Ch rom atograp h ic Resolution,CR）：也稱色層分離或?qū)游龇蛛x，在分析檢測中常稱為色譜分析（Ch rom atograp h

12、 ic Analysis,CA）它是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力，分子極性，分子形狀和大小，分子親和力，分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分配在兩個相中。其中一個相為固定的，稱為固定相；另一個相則流過此固定相，稱為流動相。當(dāng)多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。與其他分離方法相比，色譜分離具有以下基本特點：（1）分離效率高；（2）應(yīng)用范圍廣；（3）選擇性強；（4）高靈敏度的在線檢測；（5）快速分離；（6）過程的自動化操作。按分離機理不同，色譜分離可分為：1.吸附色譜（Absorption Ch rom

13、atography,AC）：混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。2.分配色譜(Distribution Ch rom atograp h y,DC)：又稱液液色譜，是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。根據(jù)分配原理進(jìn)行色譜分離操作的方法有兩種：一種是柱（紙或板）色譜分離法，其固定相是將與流動相互不相溶的液體涂漬到載體上形成的；另一種是逆流分配法，其固定相（重相）和流動相（輕相）都放在一組特別的分配管中，用來完成這種操作的儀器稱為逆流分配儀。3.離子交換色譜(Ion Exch ange Ch rom atograp h y,I

14、EC)：離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分。4.凝膠色譜（G el Ch rom atograp h y,G C）：又稱篩子分色譜以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)；5.親和色譜(Affinity Ch rom atography,AFC):常用于生物大分子的分離純化，通過把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當(dāng)含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相時，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。按固定相形狀不同，色譜技術(shù)可分為柱色譜、紙上色譜和薄層色譜三類。本實

15、驗中主要用到的時柱色譜分離和薄層色譜分離。薄層色譜主要用于定性分析，為色譜分離和高速逆流分離的準(zhǔn)備工作。2.2色譜分離的操作條件操作條件對色譜分離有很大的影響，涉及到的條件有色譜柱的柱長，柱溫，載氣流速，固定相性質(zhì)和樣品性質(zhì)，及進(jìn)樣量等問題。下面就分別來說明。柱長，柱內(nèi)徑一般講，柱管增長，可改善分離能力，短則組分餾出的快些；柱內(nèi)徑小分離效果好，柱內(nèi)徑大處理量大，但柱內(nèi)徑過大，將導(dǎo)致?lián)w不能均勻地分布在色譜柱中。分析用柱管一般內(nèi)徑為3-6毫米，柱長為1-4米。柱溫柱溫是一個重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫的根據(jù)是混合物的沸點范圍，固定液的配比和鑒定器的靈敏度。提高柱溫可縮短分

16、析時間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，柱壽命延長。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點的柱溫為較合適，對易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫。載氣流速載氣流速是決定色譜分離的重要原因之一。一般講流速高色譜峰狹，反之則寬些，但流速過高或過低對分離都有不利的影響。流速要求要平穩(wěn)，常用的流速范圍每分鐘在10-100亳升之間。固定相固定相是由固體吸附劑或涂有固定液的擔(dān)體構(gòu)成。固體吸附劑或擔(dān)體粗細(xì)：一般采用40-60目、60-8 0目、8 0-100目。當(dāng)用同等長度的柱子，顆粒細(xì)的分離效率就要比粗的好些。固定液含量：固定液含量對分離效率的影響很大，它與擔(dān)體的

17、重量比一般用15%-25%。比例過大有損于分離，比例過小會使色譜峰拖尾。進(jìn)樣一般講進(jìn)樣快，進(jìn)樣量小，進(jìn)樣溫度高其分離效果好。對進(jìn)液體樣，速度要快，汽化溫度要高于樣品中高沸點組分的沸點值，一次汽化，保證色譜峰形不致展寬、使柱效高。當(dāng)進(jìn)樣量在一定限度時，色譜峰的半峰寬是不變的。若進(jìn)樣量過多就會造成色譜柱超載。一般講柱長增加四倍，樣品的許可量增加一倍。對于常規(guī)分析，液體進(jìn)樣量為1-20微升；氣體進(jìn)樣量為0.1-5毫升。2.3柱色譜分離法吸附柱色譜色譜管為內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管,下端用棉花或玻璃纖維塞住,管內(nèi)裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻,以保證良好的分離效果。除另有規(guī)定外,通常

18、多采用直徑0.070.15m m的顆粒。色譜柱的大小,吸附劑的品種和用量,以及洗脫時的流速，均按各品種項下的規(guī)定。吸附劑的選擇及處理吸附劑分為無機吸附劑如硅膠，氧化鋁，活性炭，氧化鎂，磷酸鈣，有機吸附劑如纖維素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般來說，所選擇吸附劑應(yīng)有較大的比表面積和足夠的吸附能力：對欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力；與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；吸附劑顆粒均勻。吸附劑一般先經(jīng)過篩獲得均勻的顆粒（100-200目），對含有雜質(zhì)的吸附劑可用有機溶劑如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡處理或提取除去，有些吸附劑可用沸水洗去酸堿使呈中性，有些需經(jīng)加熱處理活化。吸附劑的填裝干法將吸附劑一次加入色譜柱，振動